利用荧光偏振方法的IDOL/LDLR蛋白相互作用评价体系的建立

目的 利用荧光偏振方法建立体外低密度脂蛋白受体的诱导型降解因子(IDOL)/低密度脂蛋白受体(LDLR)的蛋白相互作用评价体系。方法 通过PCR扩增获得人IDOL蛋白全长cDNA,并与pET-30a(+)原核表达质粒进行重组,转化至大肠杆菌系统进行表达并纯化。将FITC荧光标记的LDLR多肽片段与His-IDOL共同孵育,利用荧光偏振方法,分别对多肽浓度、蛋白浓度以及反应时间进行优化,建立体外IDOL/LDLR的蛋白相互作用评价体系。结果 将pET-30a-IDOL重组质粒进行大肠杆菌原核表达,获得人全长IDOL蛋白。将His-IDOL重组蛋白进行His Trap柱亲和纯化,并与FITC-LDLR进行反应,最终确定500 nmol/L FITC-LDLR和2μmol/L His-IDOL于25℃、100 r/min振荡、避光孵育1 h为IDOL/LDLR相互作用最适反应体系。结论 利用荧光偏振方法成功构建了IDOL/LDLR蛋白相互作用评价体系,该体系为基于IDOL/LDLR相互作用的抗动脉粥样硬化的小分子抑制剂的开发和评价提供了实验基础。