OsLEA2对乳酸脱氢酶的保护分析

在大肠杆菌DL21中表达胚胎发育后期丰富蛋白基因Os LEA2,用Hi TrapTMchelating HP层析柱纯化得到了Os LEA2蛋白。研究表明,高温会使乳酸脱氢酶的活性降低,高温处理时间的延长会增加对乳酸脱氢酶的损害;干燥脱水5 h后,乳酸脱氢酶活性几乎全部失活,其活性仅仅是未处理的3.06%;反复冻融也会降低乳酸脱氢酶的活性。在高温、脱水和冻融胁迫下,Os LEA2的加入能保护乳酸脱氢酶;随着Os LEA2的增加,乳酸脱氢酶的活性增加。因此,Os LEA2蛋白对乳酸脱氢酶具有保护作用,能减少高温、脱水和冻融对乳酸脱氢酶的损伤。

纤枝短月藓BeLEA2基因的克隆及表达分析

为探究纤枝短月藓LEA2基因的结构和表达特征,该研究以纤枝短月藓为材料,首次利用PCR克隆技术得到纤枝短月藓BeLEA2基因序列,并对该基因进行分析。结果表明:(1)该基因序列中含有2个外显子和1个内含子,其开放阅读框(ORF)为456 bp,编码151个氨基酸,预测其相对分子质量为16515.96 Da。(2)将纤枝短月藓与其他植物LEA2基因氨基酸序列进行比对,构建系统进化树,结果显示纤枝短月藓与小立碗藓的亲缘关系最近。(3)利用HiTail-PCR技术克隆获得1072 bp的BeLEA2启动子序列,用PlantCARE在线工具对该启动子的顺式作用元件进行预测,结果表明该启动子除了含有核心启动子元件TATA-box和CAAT-box外,还含有ABRE、MYB、MYC、MYB结合位点(MBS)等其他顺式元件。(4)实时荧光定量PCR分析表明,BeLEA2基因在纤枝短月藓不同发育时期和不同组织中都有表达,且对脱水胁迫有响应。以上结果为进一步探究LEA2基因在苔藓植物中的功能及作用机制奠定了基础。

甘薯LEA2基因的克隆与表达分析

胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundant,LEA)是植物在逆境胁迫下产生的一种应激蛋白质,具有较高的亲水性和热稳定性,与植物抗逆功能密切相关,研究LEA家族基因对于甘薯抗逆性分子育种具有重要意义.通过对甘薯(徐薯18)转录组数据库搜寻时发现编码LEA2的转录本,随后对该转录本进行了克隆和测序分析,利用数字表达谱(Digital Gene Expression Profi ling,DGE)和半定量RT-PCR分析了Ib-LEA2在不同组织和不同发育阶段的表达图谱.为进一步了解Ib-LEA2在生物体响应盐胁迫中的作用,将Ib-LEA2连接原核表达载体pET-32a,用大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行盐胁迫的耐受分析.结果显示:Ib-LEA2完整的开放阅读框(ORF)长度为942 bp,编码313个氨基酸残基.进一步研究发现,在甘薯组织内同时存在3个高度同源的LEA 2基因型(核苷酸序列>99%),分别命名为Ib-LEA2a、Ib-LEA2b和Ib-LEA2c.数字表达谱和半定量RT-PCR的结果显示Ib-LEA2在不同组织和发育阶段具有不同的表达图谱,在茎中的表达量远远高于叶和根.大肠杆菌BL21(DE3)菌株盐胁迫的结果显示,较之对照菌株,表达Ib-LEA2的菌株能够更好地耐受高浓度的NaCl.研究表明,Ib-LEA2对盐胁迫有一定的响应能力,能够保护细胞免受高盐的毒害.

铁皮石斛DoLEA2基因的克隆、表达及功能分析

晚期胚胎富集蛋白(late embryogenesis abundant proteins,LEA)是一种亲水、热稳定性蛋白,与植物抗逆性密切相关,研究LEA家族基因对铁皮石斛抗逆性研究具有重要意义。本研究以铁皮石斛(Dendrobium officinale)种子为材料,采用RACE技术获得全长cDNA,命名为DoLEA2(Gen Bank登录号:KY626329)。该基因全长cDNA为1 224 bp,编码313个氨基酸,具有晚期胚胎富集蛋白(LEA_2)结构域和水分胁迫高敏感响应结构域,所编码蛋白与其他物种LEA2蛋白具有较高相似性,在进化上与单子叶植物聚为一支,且与蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)亲缘关系最近。铁皮石斛DoLEA2在叶的表达量最高,根和茎次之。该基因在Escherichia coli BL21(DE3)中能够高效表达,其优化表达条件为:37℃添加终浓度0.5 mmol·L^(-1)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导4 h。盐胁迫条件下与对照组相比,重组pET28a-DoLEA2菌株表现出较好的耐盐性。本研究首次获得了铁皮石斛LEA2全长cDNA序列,验证了其耐盐胁迫功能,为进一步研究铁皮石斛抗逆性分子机制提供科学依据。

天麻晚期胚胎富集蛋白表达与抗寒性研究

目的研究天麻晚期胚胎富集蛋白(LEA2)与抗寒性的关系。方法根据天麻种子转录组测序结果,得到天麻晚期胚胎富集蛋白基因序列,获得重组质粒后导入大肠杆菌进行低温实验。结果获得两条天麻LEA2基因c DNA序列。GeLEA2-1和GeLEA2-2全长分别为477和942 bp,编码158和313个氨基酸,其编码蛋白理论相对分子质量为17.30×103和34.85×103。系统发育分析显示,天麻LEA2基因分别与拟南芥和水稻LEA2基因具有较高相似性。此外,天麻LEA2基因与已知的多种植物的LEA2蛋白具有相似的功能结构域。低温实验显示,与对照组相比,含有GeLEA2重组质粒的大肠杆菌的抗寒性较差。结论推测天麻LEA2为抗寒相关的负向调节基因。