西藏青稞LEA3蛋白新抗旱基因的克隆与序列分析

以强抗旱青稞冬青8号和弱抗旱青稞品比14为材料,将幼苗经干旱诱导处理12 h提取总RNA,RT-PCR同源克隆到2个有差异的LEA3蛋白抗旱基因的全编码框序列。冬青8号、品比14的LEA3蛋白基因序列全长分别为661 bp和694 bp,其中,来源于品比14的LEA3蛋白基因编码框全长639 bp,编码含213个氨基酸残基的蛋白质,该多肽含有9个重复的、由11个氨基酸残基组成的保守基元序列。而来源冬青8号的LEA3蛋白基因与之相比较除缺少33 bp核苷酸外,另有6个碱基的差异,所编码的蛋白质也相应地缺少第4个保守基元序列,由8个重复的保守基元序列组成。二者在DNA与氨基酸序列上的同源性分别为94.38%和92.02%。结果证实抗旱性不同的青稞品种之间LEA3抗旱蛋白保守基元拷贝数有差异,推测抗旱蛋白结构的差异可能对植物的抗旱性有影响。

外源lea3基因转化紫花苜蓿的研究

将来源于大麦的lea3基因通过基因枪法导入紫花苜蓿栽培品种“中苜一号”的胚性愈伤组织中,经过膦丝菌素类除草剂(PPT)的4次筛选获得抗性愈伤组织,诱导分化后共获得21株抗性再生植株。经叶片涂抹除草剂试验和lea3基因的PCR分子检测证明,lea3基因已整合到紫花苜蓿的基因组中。与对照植株相比,获得的转基因植株具有显著增强的耐盐能力,表明遗传转化lea3基因可用于苜蓿抗旱耐盐新品种的选育。

植物抗逆蛋白(LEA3)22-氨基酸耐盐结构域在酵母细胞中的鉴定

大豆PM2蛋白属LEA3(late embryogenesis abundant3)蛋白。本文构建了编码PM2全长及含22-氨基酸结构域多肽(PM2、PM2A、PM2B和PM2C)的酵母表达载体。转化酵母得到四种重组菌。SDS-PAGE电泳和ESI-MS/MS或MALDI-TOF/TOF质谱结果表明,重组菌可表达目标多肽。测定对照菌及重组菌在无胁迫、高盐(1.5mol.L-1NaCl)和高渗透(2mol.L-1山梨糖)下的生长曲线。结果表明,在高盐胁迫下,四种重组菌胁迫后的恢复明显好于对照菌。多肽对高盐耐受能力的大小为:PM2C>PM2B≈PM2A≈PM2。证明大豆PM2蛋白的表达可提高酵母耐盐性,且22-氨基酸基序为PM2蛋白的耐盐结构域。结合前文在大肠杆菌中的结果,为"LEA蛋白可以类似机制参与原核和真核生物耐盐保护作用"的假说提供实验支持。然而,在高山梨糖胁迫下,对照菌和酵母重组菌的生长情况无明显差异。

黄花苜蓿LEA3基因片段克隆与生物信息学分析

根据紫花苜蓿LEA3-1 mRNA(EU665182)的cDNA序列,设计1对特异引物,以经过ABA干旱胁迫处理的黄花苜蓿为材料,提取总RNA。采用RT-PCR方法克隆获得了747 bp的cDNA片段,命名为MfLEA3-1(GenBank登录号:HQ327439)。推测该序列编码了248个氨基酸,这些氨基酸主要由10.1%苏氨酸(Thr)、24.6%丙氨酸(Ala)、17.7%赖氨酸(Lys)和12.9%天冬氨酸(Asp)组成,不含有半胱氨酸和色氨酸,这与其他物种LEA蛋白成分非常接近。该氨基酸序列中存在13个11-mer重复序列,根据第3组蛋白分类标准,MfLEA3-1蛋白比较接近于type I,但是11-mer重复中残基分布与type I有所不同,推测MfLEA3-1蛋白属于新的第3组LEA蛋白类型。黄花苜蓿中成功获得了LEA3基因片段,为最终克隆黄花苜蓿LEA3基因序列全长奠定基础。

旱麦草LEA3基因的克隆与序列分析

为了克隆旱麦草LEA3基因,根据小麦的LEA3基因(GenBank登录号为AY148492)cDNA序列设计引物,以干旱胁迫处理的旱麦草幼苗的cDNA为模板,采用RT-PCR克隆了旱麦草LEA3基因,命名为EtLEA3(GenBank登录号为KJ123698),并对基因及其蛋白进行了生物信息学分析。结果表明:EtLEA3基因的ORF全长为600 bp,编码199个氨基酸,推测的蛋白相对分子量为20.38 ku,理论等电点为9.08。其氨基酸序列与小麦、大麦和山羊草LEA3蛋白的相似性分别为83%、82%和81%。信息学分析表明EtLEA3蛋白具有较高的亲水性,没有跨膜结构。蛋白质二级结构和三级结构预测表明α-螺旋结构占主导,与目前已知的多种植物的LEA3蛋白具有相似的结构功能域。该蛋白含有5个完整的11个氨基酸组成的串联重复单元。这些特征均与第3组LEA蛋白的特征相符合。该研究结果为深入了解该基因的功能和旱麦草抗旱的分子机理提供了基础数据。

大豆PM2蛋白(LEA3)表达可提高酵母重组子的耐盐性

大豆PM2蛋白属LEA3(late embryogenesis abundant group3)蛋白。本实验以含大豆PM2基因的重组载体pET28a/PM2为模板,PCR法构建酵母表达载体pYES2/PM2,并转化酵母细胞得到重组菌INV/PM2。SDS-PAGE电泳结果表明,INV/PM2重组菌可被诱导表达分子量约为50 kDa的蛋白条带,与目的蛋白的理论分子量(50 kDa)接近。利用液相色谱-电喷雾质谱对酵母重组子表达的重组蛋白进行分析鉴定。分别测定未转基因重组菌INV/pYES2和转PM2基因的重组菌INV/PM2在无胁迫、和含1.8 mol/LNaCl2、mol/L山梨糖培养基中的生长曲线。结果表明大豆PM2蛋白的表达对酵母正常生长没有影响。在含高盐的培养基里,转PM2基因酵母INV/PM2的延滞期短于对照菌。这表明PM2蛋白的表达可以提高酵母细胞的耐盐能力。但是在含山梨糖的高渗培养基里,两种菌的生长情况无明显差异。

茭白lea3基因全长cDNA的分离克隆及序列分析

第3组胚胎晚期丰富蛋白(LEA3)是一组在胚胎发育后期丰富表达的蛋白,同时它还受水分胁迫和ABA的诱导,与植物抗旱性密切相关。本研究以经过干旱处理的茭白幼苗的mRNA为模板,根据禾本科lea3基因的保守序列设计简并引物进行RT-PCR,得到lea3基因的部分序列,然后结合RACE方法获得全基因两端的序列,经拼接得出茭白lea3基因的全长cDNA,序列分析结果表明该基因的开放阅读框为666bp,编码221个氨基酸,包含2个LEA3基元序列。通过与已报道的LEA3蛋白序列比较,与禾本科中水稻、大麦、小麦、雀麦、玉米的同源性分别为51.2%、41.0%、41.1%、42.0%和40.5%。最终得出结论,茭白lea3基因具有已知物种lea3基因的特征,可以为该基因的功能研究提供参考。目前,该基因已在GenBank中登录,编号为GQ494017。

地高辛标记LEA3蛋白基因探针的制备及其在转基因草莓核酸杂交中的应用

用地高辛对胚胎发生晚期丰富蛋白LEA3基因片段(1.0 kh)进行了探针标记。斑点杂交表明,该探针的检测灵敏度为5 Pg。用地高辛标记和未标记的标准分子量DL 2000进行杂交时,只检测到2.00、1.00、0.75、0.50 kb4条杂交带。应用LEA3探针对转基因草莓(Fragaria ananassa Duch.)进行了Southern blot分析,检测到1.0 kh杂交带,表明外源LEA3基因整合到草莓染色体上。

烟草LEA3基因的克隆及序列分析

为从烟草中克隆到与植物抗逆相关的胚胎晚期丰富蛋白(LEA)基因,以番茄LEA3基因为探针,通过电子克隆的方法从烟草栽培品种K326中克隆到2个第3组LEA基因(NtLEA3-1和NtLEA3-2),并对其进行了序列分析。结果表明:2个LEA3基因的cDNA序列均包含完整的开放读码框,分别编码167和166个氨基酸,具有8个LEA3基元序列。亲水性分析表明NtLEA3-1和NtLEA3-2蛋白富含亲水氨基酸,是一种高度亲水性的蛋白,其蛋白二级结构中均以α-螺旋构象为主。NtLEA3-1和NtLEA3-2的氨基酸序列与番茄的一致性最高为79%,与其他已经发现的LEA3蛋白的一致性在42%～62%之间,表明NtLEA3-1和NtLEA3-2是2个新的烟草LEA3基因。

高羊茅黔草1号和黔草2号LEA3基因克隆与苗期干旱胁迫表达

【目的】克隆贵州本地高羊茅品种黔草1号和黔草2号的第三组晚期胚胎发生丰富蛋白(Late Embryogenesis Abundant Protein,Group 3,LEA3)基因,分析其生物信息学及其苗期干旱胁迫的表达量变化,为进一步探讨LEA3基因的功能和高羊茅抗旱分子机制提供理论基础。【方法】参照NCBI已登录大麦LEA3基因序列,利用RT-PCR获得黔草1号和黔草2号LEA3基因cDNA序列,应用相关软件对氨基酸序列进行分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析苗期干旱胁迫的表达量。【结果】黔草1号和黔草2号LEA3基因完整的ORF框长度分别为609和642 bp,分别编码203个氨基酸和213个氨基酸;黔草1号LEA3蛋白比黔草2号缺失1个基元序列(包含11个氨基酸),且两者LEA3基因编码的氨基酸序列存在12个位点的氨基酸差异;黔草1号LEA3基因编码蛋白分子量为20.72 kDa,等电点8.55,总平均亲水性为-0.971;黔草2号LEA3基因编码蛋白分子量为22.01 kDa,等电点8.99,总平均亲水性为-1.069;两者的LEA3蛋白均没有跨膜结构,且均以α-螺旋结构占主导,与大麦、山羊草、冰草和小麦的LEA3具有高度的同源性,与小麦、旱麦草、大麦、山羊草、无芒雀麦、冰草的LEA3蛋白聚为一类;苗期干旱胁迫下黔草1号LEA3基因的表达量在整个胁迫过程中总体高于黔草2号,2个品种高羊茅在-2.5 MPa PEG 6000胁迫下的LEA3基因表达量高于-1.5 MPa PEG 6000胁迫。【结论】黔草1号和黔草2号的抗旱性与LEA3基因的表达量呈正相关,相同干旱胁迫条件下,黔草1号LEA3的表达量高于黔草2号,推测在受到干旱胁迫时,黔草1号更能适应干旱环境。

小麦TaLEA3基因家族的全基因组鉴定及其响应赤霉病的表达模式分析

胚胎晚期丰富(late embryogenesis abundant,LEA)蛋白是高等植物胚胎发育后期种子中大量积累的一类蛋白质,在植物逆境胁迫方面具有重要作用。其中第三组的LEA蛋白(LEA3)是该类蛋白家族的主要成员,因其在植物抗旱耐盐性方面的卓越表现而被广泛研究。在前期研究中,通过高通量蛋白质组学的方法,在禾谷镰刀菌接种的小麦穗轴中筛选到1个与抗病相关的差异积累蛋白Wrab17(LEA3基因家族)。为了揭示小麦中TaLEA3基因家族的序列特征及其对生物胁迫的响应机制,采用生物信息学方法对该基因家族进行了系统研究。结果表明,在小麦全基因组中共鉴定到26个TaLEA3基因,命名为TaG3LEA-1~TaG3LEA-26,分布于小麦的9条染色体上。串联重复和片段复制是该基因家族扩张的主要方式;MEME分析表明该家族成员含有motif 2或motif 5,是LEA3家族的典型特征。通过基因表达分析和qRT-PCR验证,发现TaG3LEA-25在干旱和高温胁迫下均高表达,并且在不同赤霉病抗感材料间存在显著差异,推测其可能参与了小麦赤霉病抗性调控。研究结果为阐明小麦TaLEA3家族基因的进化关系提供了有价值的信息,并且为进一步探究其功能机制奠定了理论基础。

金发草LEA3基因2个剪接体转化烟草的抗干旱胁迫能力分析

【目的】为进一步鉴定金发草LEA3基因2个剪接体蛋白亲水能力和结构上的改变导致在抗逆能力方面的差异。【方法】本研究利用植物表达系统分析了2个剪接体在烟草体内的功能以及功能之间的差异。以PpLEA3基因2个剪接体(PpLEA3.a和PpLEA3.b)的重组载体pMD19-T-PpLEA3.a和pMD19-T-PpLEA3.b为模板,PCR法构建植物表达载体pBI121-PpLEA3.a和pBI121-PpLEA3.b,并分别转化烟草得到转基因烟草Nt-PpLEA3.a和Nt-PpLEA3.b。【结果】首先对转基因烟草进行分子检测,发现其基因组DNA和RT-PCR检测均表现为阳性,说明外源基因已整合到烟草基因组并可以正常转录表达。随后筛出转基因烟草并收获T2代种子后,对其进行抗旱生理特性分析,发现在遭受甘露醇150 mM的模拟干旱胁迫后,转基因植株均比野生植株生长状况好,野生植株相对矮小,叶片萎蔫,生长畸形,而转基因植株整体受损情况要好很多。同时分析了此模拟干旱条件下转基因植株与野生型植株的丙二醛含量、叶绿素含量和相对电导率的变化。【结论】转基因烟草在干旱胁迫下表现出良好的耐受性,耐受能力PpLEA3.a>PpLEA3.b。进一步说明序列上的差异对基因的抗干旱能力功能起着重要作用。

铁皮石斛外源lea3基因的转化及耐盐性分析

利用基因枪法将来源于大麦(Hordeum vulgare L.)的抗旱耐盐基因lea3导入铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ex Lindl)的类原球茎(PLBs)中,经膦丝菌素类除草剂PPT筛选2次获得抗性PLBs,于无选择压下分化获得不定芽,再经PPT筛选和生根壮苗培养获得转化植株.对转化植株进行除草剂PPT叶片涂抹检测和lea3基因的PCR检测,表明lea3基因已整合到6个株系7株铁皮石斛转化植株基因组中,转化频率为1.05%.与对照相比,获得的转基因植株的耐盐胁迫能力明显增强,表明遗传转化lea3基因可用于石斛抗旱耐盐新品种的选育.

高粱LEA3蛋白基因和启动子的克隆及序列分析

根据禾本科LEA3基因保守序列设计简并引物,同时结合RACE方法获得高粱LEA3基因全长cDNA序列1032 bp,该序列含有一个612 bp的阅读框,编码203个氨基酸,包含7个串联的LEA3蛋白的基元序列。通过与玉米、小麦、水稻、大麦的LEA3蛋白序列比较,氨基酸序列同源性分别为73.8%、53.77%、45.63%和53.99%;其编码蛋白理论相对分子量为21.22 kD,等电点pI=8.79;蛋白质二级结构预测表明2段α螺旋结构占主导,与目前已知的多种植物的LEA3蛋白具有相似的结构功能域。通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术获得LEA3基因启动子749 bp的DNA序列,该区域包含ABA应答元件、干旱胁迫应答元件、以及胚胎和胚乳特异表达元件;通过PHyML软件构建了禾本科植物LEA3基因ML系统树。这些研究结果为深入了解该基因的功能和高粱抗旱的分子机理提供了基础数据。

第三组胚胎晚期丰富蛋白lea3基因研究概述

晚期胚胎富集蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA蛋白)是在高等植物胚胎发育晚期大量积累的一类蛋白,根据其结构特点LEA蛋白一般分为6组,其中第3组LEA蛋白(LEA3)含有11个氨基酸串联重复的基元序列,可以形成α-螺旋结构,能在干旱胁迫的环境中保护生物大分子,减轻水份胁迫对植物造成的伤害,与植物抗逆性密切相关。该文就lea3基因及其蛋白的结构、功能、基因表达和应用等进行简要的综述,并对lea3基因及其蛋白今后的研究方向和应用前景进行了展望。

金发草LEA3基因两个剪接体转化酿酒酵母的抗非生物胁迫功能分析

对金发草(Pogonatherum paniceum)第3组LEA蛋白(PpLEA3)基因两个剪接体进行分析,并利用酿酒酵母表达系统分析两个剪接体在不同非生物胁迫的响应差异。以PpLEA3基因两个剪接体(PpLEA3.a和PpLEA3.b)的重组载体pMD19-T-PpLEA3.a和pMD19-T-PpLEA3.b为模板,PCR法构建酵母表达载体pYES2-PpLEA3.a和pYES2-PpLEA3.b,并转化酿酒酵母细胞得到重组菌INV-PpLEA3.a和INV-PpLEA3.b。通过比较重组菌和对照菌(转空载体pYES2)在NaCl、NaHCO3、低温、干旱、UV胁迫下的恢复生长状况,结果表明两种重组菌胁迫后的生长情况明显好于对照菌,两个剪接体对非生物胁迫抵抗力的大小为:PpLEA3.a>PpLEA3.b。两个剪接体在核酸序列上的差异导致了在蛋白亲水性和结构上的差异,最终导致了在抗逆能力方面的差异。

竹亚科lea3基因的进化分析

选取竹亚科中两个超族、六个族和三个亚族的10个竹种为材料,分别是泰竹、凤尾竹、青皮竹、大叶慈、慈竹、野龙竹、毛竹、香竹、苦竹、菲白竹,分离克隆了它们的lea3基因,并将它们与外类群物种水稻进行序列比对和进化分析。结果发现在分支模型与分支位点模型的检测中,不同竹种所含lea3基因承受了不同的正选择压力,清除选择作用在lea3基因编码区中占主导地位(ω<1)。在位点模型的检测中,共检测出了18个显著性正选择位点,占总氨基酸数目的 11.1%。对这18个显著性正选择位点进行定位后,发现其中的15个位于11个氨基酸串联重复序列附近。这说明lea3基因中的11个氨基酸串联重复序列区比基因其它区域更容易受自然选择作用影响。同时,在位点模型检测结果的基础上,通过对强烈清除选择位点的定位,发现在11个氨基酸串联重复序列区内存在一长段无强烈清除位点的序列区。

非生物胁迫下戈壁异常球菌LEA3蛋白Dgl3抗逆功能研究

LEA3(group 3 late embryogenesis abundant proteins)是一类非生物胁迫响应蛋白,能够保护细胞免受胁迫损伤。戈壁异常球菌(Deinococcus gobiensis) I-0分离于干旱、温差大及强阳光辐射的戈壁沙漠环境,具有超强的耐受紫外(UV)辐射、电离辐射和干燥等胁迫的能力,其基因组中Dgo_CA1631基因编码蛋白与LEA3具有一定同源性,将该蛋白命名为Dgl3,并对其生物学功能展开研究。非生物胁迫实验表明,Dgl3蛋白能够显著增强表达菌株BL21对氧化和冷冻胁迫的抗性,最大限度地保护宿主菌免受损伤。体外酶活保护实验结果进一步表明,氧化和反复冻融胁迫条件下Dgl3蛋白能够保护苹果酸脱氢酶(MDH)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性。因此推测,Dgl3蛋白通过保护细胞体内相关酶类的活性,增强宿主细胞对氧化和冷冻胁迫的抵抗能力。

芸香草CdLEA3基因的克隆及原核表达分析

本研究以芸香草为试验材料,采用RT-PCR和RACE技术对芸香草CdLEA3基因进行了分离克隆以及原核分析,并进行了生物信息学分析与原核表达分析。结果显示,芸香草CdLEA3基因的cDNA全长为934 bp,含627 bp的最大开放阅读框,编码208个氨基酸;生物信息学分析表明,CdLEA3基因编码蛋白的分子质量预测为21.6 kD,包含75.5%的亲水性氨基酸,不稳定指数为34.5,具有极强的亲水性,属于稳定性强的亲水性蛋白。CdLEA3基因编码蛋白的二级结构主要为α-螺旋结构;SDS-PAGE分析表明CdLEA3蛋白分子质量约为22 kD,且全部在上清液中表达。本研究通过对芸香草CdLEA3基因克隆分析,为进一步研究CdLEA3基因的分子作用机制及功能提供科学依据。

小琴丝竹和凤尾竹LEA3基因的克隆及分析

中国竹类植物资源丰富,栽培历史悠久,是集生态、经济和社会价值于一身的园林植物。本研究以小琴丝竹和凤尾竹为材料提取叶片总DNA,通过PCR扩增技术克隆得到2种竹类植物LEA3基因,其中小琴丝竹LEA3基因全长810 bp,编码区序列编码188个氨基酸,GC含量为67.9%;凤尾竹LEA3基因全长分别为810 bp和834 bp,编码区序列分别编码188个氨基酸和195个氨基酸,GC含量为67.72%和68.53%。通过DNAMAN等生物软件分析发现,小琴丝竹和凤尾竹LEA3基因与其他禾本科LEA3基因同源性均在77%以上,同源性较高,且编码蛋白均属于稳定的亲水蛋白;此外,小琴丝竹和凤尾竹LEA3基因均包含一个完整的开放阅读框,其编码的氨基酸均含有6个由11个氨基酸组成的保守基元序列,本研究不仅为分析其他竹类植物的脱水耐受性机制提供基础数据,同时也为竹类植物及其他农作物抗旱育种提供了科学依据。