人ATP7B基因对Wilson病动物模型LEC大鼠暴发性肝炎的治疗

目的 探讨人ATP7B基因对Wilson病动物模型LEC大鼠暴发性肝炎的治疗效果。 方法 将构建的 7.1kb含有鸡 β肌动蛋白启动子的人正常ATP7BcDNA ,经显微注射法导入人Wilson病动物模型LEC(long EvansCinnamon)大鼠受精卵 ,建立转基因功能恢复大鼠模型。以Westernbolt检测人ATP7B在转基因大鼠肝内的表达 ,用同窝无转基因大鼠及正常野生型LEA大鼠作对照 ,对 6～ 16周龄的转基因大鼠的血清AST、ALT和总胆红素水平进行连续测定 ,同时取 13周龄转基因大鼠的肝组织进行病理学和组织化学分析。 结果 人ATP7B基因在转基因大鼠的肝组织中获得正确和完整的表达 :12周龄前后 ,与同窝无转基因大鼠相比 ,转基因大鼠的血清AST、ALT和总胆红素水平明显降低 ,肝组织的炎性病变显著减轻 ,肝细胞内铜的蓄积减少 ;至 16周龄 ,转基因大鼠的临床表型未见异常 ,存活率达 10 0 %。说明人ATP7B的导入 ,成功地抑制了Wilson病动物模型LEC大鼠的暴发性肝炎的发生。结论 Wilson病肝炎的发生与ATP7B基因功能缺陷引起的铜蓄积有直接关系。基因转移有可能是一种有效的治疗Wilson病的方法。

用镭射激光捕获技术研究LEC鼠P53基因突变和肝癌发生的关系

目的研究P53基因突变与原发性肝癌发生发展的关系。方法利用LEC鼠(long evan cinnamon)作为肝癌的动物模型。选取15周,37周,101周的LEC鼠15,14和10只,正常对照SD大鼠15只,取出肝脏组织进行切片。切片一部份用于GST-P免疫组化(immunohistochemistry,IHC)染色,另一部份利用镭射激光捕获技术(laser capture microdissection,LCM)定位切割,进行P53基因外显子5,6/7,8突变的分析。结果37周龄LEC鼠和101周龄LEC鼠GST-P阳性率高于对照组(P<0.005),15周龄LEC鼠GST-P阳性率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。P53基因在GST-P表达阳性肝炎组有3例突变(3/11),GST-P表达阳性肝癌组有10例发生突变(10/15),肝癌组显著高于肝炎组(P<0.05)。结论P53的突变发生在肝癌形成的早期阶段,随着发展过程,突变率明显增高。GST-P虽然特异性不强,但是不失为一种灵敏的判断肝损伤的指标。

人ATP7B基因对Wilson病动物模型LEC大鼠肝硬化及肝癌的治疗

目的 探讨人ATP7B基因对Wilson病动物模型LEC(Long EvansCinnamon)大鼠肝硬化及肝癌的治疗效果。 方法 将 7 1kb含有鸡 β肌动蛋白启动子的人正常ATP7BcDNA ,经显微注射法导入Wilson病动物模型LEC大鼠受精卵 ,建立转基因功能恢复大鼠模型。以无转基因大鼠及正常野生型LEA大鼠为对照 ,对 17～ 30周龄的转基因大鼠的血清AST、ALT水平进行连续测定 ,同时取 30和 6 0周龄转基因大鼠的肝脏进行病理组织学和组织化学分析。 结果 17～ 30周龄 ,转基因大鼠的血清丙氨酸氨基转移酶 (AST)、天门冬氨酸氨基转移酶 (ALT)保持在较低的水平。至 6 0周龄 ,雄性转基因大鼠肝组织未见胆管纤维化。在所有被检的转基因大鼠个体未见肝细胞癌性病变。转基因大鼠的存活率达 95 7%。此外 ,30和 6 0周龄的转基因大鼠肝细胞内铜着色颗粒的分布及数量无明显变化。 结论 人ATP7B的导入有效的延缓了Wilson病动物模型LEC大鼠肝硬化的形成、抑制了肝癌的发生。Wilson病的肝硬化及肝癌的发生可能与铜的蓄积无直接关系。

LEC鼠自发性肝癌谷胱甘肽S-转移酶表达的意义

目的 :观察 L EC大鼠自发性肝癌谷胱甘肽 S-转移酶 (GST- P)的蛋白表达 ,探讨 GST- P对原发性肝癌早期诊断的价值。方法 :采用免疫组织化学方法检测 L EC大鼠肝脏 GST- P的表达。结果 :6 7周龄 L EC鼠即肝癌组 GST- P的表达率 (96 .97% )明显高于 4～ 6个月龄 L EC鼠即肝炎组 (37.5 % )及 SD大鼠组 (9.38% )的表达率 (P<0 .0 1) ,4～ 6个月龄 L EC鼠 GST- P的表达率高于 SD大鼠组 (P<0 .0 5 )。结论 :GST- P可作为大鼠原发性肝癌早期诊断的肿瘤标志物。

人ATP7B转基因大鼠模型的建立及其在转基因大鼠体内的表达分析

目的利用受精卵的雄性原核显微注射法,建立人ATP7B转基因大鼠模型。方法将构建7.1kb含有鸡β肌动蛋白启动子的人正常ATP7BcDNA,经显微注射法导入Wilson’s病动物模型LEC(Long-Evans Cinnamon)大鼠的受精卵,利用PCR法筛选、鉴定阳性转基因大鼠,以RT-PCR和Western bolt检测人ATP7B在转基因大鼠体内的表达,并从血液生化指标和临床症状上对16周龄内的阳性转基因大鼠进行分析。结果建立了3株独立的转基因大鼠株系,其中2株转基因大鼠的肝组织中可检测到完整的人ATP7B基因表达产物,血液生化和临床指征显示2株转基因大鼠具有明显的ATP7B相关功能恢复表型。结论人ATP7B在转基因大鼠的肝组织中获得完整和正确的表达,其弥补了转基因大鼠内源性Atp7b基因功能的缺陷。

Ccnd1反义寡核苷酸脂质体抑制大鼠晶状体上皮细胞增殖的研究

目的:探索Ccnd1反义寡核苷酸(Ccnd1-ASON)脂质体对培养的大鼠晶状体上皮细胞(LEC)Ccnd1基因表达和细胞增殖的抑制作用。方法:分别用不同浓度的Ccnd1-ASON脂质体(反义组)、Ccnd1正义寡核苷酸(Ccnd1-SON)脂质体(正义组)、空白脂质体(空白组)转染培养的SD大鼠LEC。转染后24h、72h、120h,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测LEC中Ccnd1表达变化;转染后24h、48h、72h、96h和120h,MTT法连续测定细胞增殖的状况。应用方差分析进行统计学处理。结果:转染后24h、72h、120h,反义组与正义组和空白组相比较Ccnd1表达量均下降,正义组与空白组比较无明显变化。转染后24h内3组细胞增殖未见明显差别;转染后48～120h,反义组的细胞增殖明显慢于正义组和空白组(P<0.05),正义组与空白组之间无明显差异(P>0.05)。结论:Ccnd1-ASON脂质体能有效降低大鼠LEC Ccnd1表达,抑制LEC增殖。

CD4 T细胞缺乏对胸腺细胞凋亡影响的研究

通过对ＬＥＣ大鼠和正常对照鼠胸腺细胞的凋亡的研究，探讨了ＣＤ４Ｔ细胞缺乏对胸腺细胞凋亡的影响。电子显微镜、抗ｓｓ－ＤＮＡ抗体免疫细胞化学染色及ＤＮＡ片段梯形电泳带结果提示：ＣＤ４Ｔ细胞缺乏可诱导不成熟Ｔ细胞凋亡，对成熟Ｔ细胞无明显影响。

人ATP7B基因在转基因大鼠的铜代谢通路中的功能分析

目的 利用转基因大鼠模型 ,研究人Wilson病致病基因ATP7B在铜代谢通路中的功能。方法 将构建的 7 1kb含有鸡 β肌动蛋白启动子的人正常ATP7BcDNA ,经显微注射法导入Wilson病动物模型LEC(long_evanscinnamon)大鼠受精卵的雄性原核。以RT_PCR和Westernblot分析其在转基因大鼠各组织内的表达谱 ;用抗大鼠铜蓝蛋白抗体检测肝细胞全铜蓝蛋白 (holoceruloplasmin)的合成 ;同时对 6～ 30周龄的转基因大鼠血清铜蓝蛋白亚铁氧化酶活性、血清铜浓度、胆汁的铜分泌量、以及肝、肾和脑组织中的铜含量进行分年龄段连续测定和统计学分析。结果 在转基因大鼠体内 ,ATP7B在各种组织中获得广泛表达 ,其中肝和肌肉中的表达水平较高 ,肝细胞恢复了全铜蓝蛋白的合成 ,血清中的铜含量及胆汁的铜排泄量增加 ,肝、肾组织中的铜蓄积减少。结论 完整表达人ATP7B基因产物的转基因大鼠的肝细胞 ,通过CPN介导的铜向血清的分泌和调节铜向胆汁的排泄 ,恢复了ATP7B参与铜转运功能 ,Wilson病的铜蓄积与ATP7B基因的突变直接相关。

慢病毒介导ATP7B基因转染对骨髓间充质干细胞在高铜环境中生存能力的影响

目的:探讨慢病毒转染ATP7B基因能否提高骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,MSCs)在高铜环境中的生存能力。方法:全骨髓贴壁法培养Wilson病模型LEC大鼠的MSCs;构建含有ATP7B基因的慢病毒载体pWPT-ATP7B及对照慢病毒载体pWPT-GFP并转染MSCs,获得表达ATP7B基因的MSCsATP7B细胞及对照组MSCsGFP细胞。利用细胞免疫荧光、Real-time PCR、Western blot长期监测ATP7B基因表达;并以HepG2细胞系作为阳性对照,利用SRB法监测给予不同浓度铜离子处理的干细胞增殖情况。结果:MSCs CD90、CD29表达阳性,CD45、CD11b表达阴性;细胞免疫荧光、Westernblot及RT-PCR显示MSCsATP7B细胞的ATP7B基因能够长期稳定表达;SRB结果显示,高铜环境中MSCsATP7B细胞的生存能力显著高于MSCsGFP细胞及HepG2(P<0.05)。结论:ATP7B基因修正的LEC大鼠MSCs可有效对抗铜蓄积损害,为Wilson病的治疗提供可能的新方法。