用镭射激光捕获技术研究LEC鼠P53基因突变和肝癌发生的关系

目的研究P53基因突变与原发性肝癌发生发展的关系。方法利用LEC鼠(long evan cinnamon)作为肝癌的动物模型。选取15周,37周,101周的LEC鼠15,14和10只,正常对照SD大鼠15只,取出肝脏组织进行切片。切片一部份用于GST-P免疫组化(immunohistochemistry,IHC)染色,另一部份利用镭射激光捕获技术(laser capture microdissection,LCM)定位切割,进行P53基因外显子5,6/7,8突变的分析。结果37周龄LEC鼠和101周龄LEC鼠GST-P阳性率高于对照组(P<0.005),15周龄LEC鼠GST-P阳性率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。P53基因在GST-P表达阳性肝炎组有3例突变(3/11),GST-P表达阳性肝癌组有10例发生突变(10/15),肝癌组显著高于肝炎组(P<0.05)。结论P53的突变发生在肝癌形成的早期阶段,随着发展过程,突变率明显增高。GST-P虽然特异性不强,但是不失为一种灵敏的判断肝损伤的指标。

LEC鼠自发性肝癌谷胱甘肽S-转移酶表达的意义

目的 :观察 L EC大鼠自发性肝癌谷胱甘肽 S-转移酶 (GST- P)的蛋白表达 ,探讨 GST- P对原发性肝癌早期诊断的价值。方法 :采用免疫组织化学方法检测 L EC大鼠肝脏 GST- P的表达。结果 :6 7周龄 L EC鼠即肝癌组 GST- P的表达率 (96 .97% )明显高于 4～ 6个月龄 L EC鼠即肝炎组 (37.5 % )及 SD大鼠组 (9.38% )的表达率 (P<0 .0 1) ,4～ 6个月龄 L EC鼠 GST- P的表达率高于 SD大鼠组 (P<0 .0 5 )。结论 :GST- P可作为大鼠原发性肝癌早期诊断的肿瘤标志物。

人ATP7B基因对Wilson病动物模型LEC大鼠暴发性肝炎的治疗

目的 探讨人ATP7B基因对Wilson病动物模型LEC大鼠暴发性肝炎的治疗效果。 方法 将构建的 7.1kb含有鸡 β肌动蛋白启动子的人正常ATP7BcDNA ,经显微注射法导入人Wilson病动物模型LEC(long EvansCinnamon)大鼠受精卵 ,建立转基因功能恢复大鼠模型。以Westernbolt检测人ATP7B在转基因大鼠肝内的表达 ,用同窝无转基因大鼠及正常野生型LEA大鼠作对照 ,对 6～ 16周龄的转基因大鼠的血清AST、ALT和总胆红素水平进行连续测定 ,同时取 13周龄转基因大鼠的肝组织进行病理学和组织化学分析。 结果 人ATP7B基因在转基因大鼠的肝组织中获得正确和完整的表达 :12周龄前后 ,与同窝无转基因大鼠相比 ,转基因大鼠的血清AST、ALT和总胆红素水平明显降低 ,肝组织的炎性病变显著减轻 ,肝细胞内铜的蓄积减少 ;至 16周龄 ,转基因大鼠的临床表型未见异常 ,存活率达 10 0 %。说明人ATP7B的导入 ,成功地抑制了Wilson病动物模型LEC大鼠的暴发性肝炎的发生。结论 Wilson病肝炎的发生与ATP7B基因功能缺陷引起的铜蓄积有直接关系。基因转移有可能是一种有效的治疗Wilson病的方法。

人ATP7B基因对Wilson病动物模型LEC大鼠肝硬化及肝癌的治疗

目的 探讨人ATP7B基因对Wilson病动物模型LEC(Long EvansCinnamon)大鼠肝硬化及肝癌的治疗效果。 方法 将 7 1kb含有鸡 β肌动蛋白启动子的人正常ATP7BcDNA ,经显微注射法导入Wilson病动物模型LEC大鼠受精卵 ,建立转基因功能恢复大鼠模型。以无转基因大鼠及正常野生型LEA大鼠为对照 ,对 17～ 30周龄的转基因大鼠的血清AST、ALT水平进行连续测定 ,同时取 30和 6 0周龄转基因大鼠的肝脏进行病理组织学和组织化学分析。 结果 17～ 30周龄 ,转基因大鼠的血清丙氨酸氨基转移酶 (AST)、天门冬氨酸氨基转移酶 (ALT)保持在较低的水平。至 6 0周龄 ,雄性转基因大鼠肝组织未见胆管纤维化。在所有被检的转基因大鼠个体未见肝细胞癌性病变。转基因大鼠的存活率达 95 7%。此外 ,30和 6 0周龄的转基因大鼠肝细胞内铜着色颗粒的分布及数量无明显变化。 结论 人ATP7B的导入有效的延缓了Wilson病动物模型LEC大鼠肝硬化的形成、抑制了肝癌的发生。Wilson病的肝硬化及肝癌的发生可能与铜的蓄积无直接关系。

Wilson病的动物模型研究进展

Wilson病(Wilson’s disease,WD)又称肝豆状核变性,是一种常染色体隐性遗传病,系染色体13q14.3区的ATP7B基因突变致肝细胞铜转运障碍[1],造成铜大量沉积于肝、脑、肾等组织,可出现肝硬化、神经/精神症状、肾损害、角膜K-F环等临床表现,严重者可危及生命。目前国内对于Wilson病的相关研究主要集中于分子水平的ATP7B基因和蛋白分析研究。

慢病毒介导ATP7B基因转染对骨髓间充质干细胞在高铜环境中生存能力的影响

目的:探讨慢病毒转染ATP7B基因能否提高骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,MSCs)在高铜环境中的生存能力。方法:全骨髓贴壁法培养Wilson病模型LEC大鼠的MSCs;构建含有ATP7B基因的慢病毒载体pWPT-ATP7B及对照慢病毒载体pWPT-GFP并转染MSCs,获得表达ATP7B基因的MSCsATP7B细胞及对照组MSCsGFP细胞。利用细胞免疫荧光、Real-time PCR、Western blot长期监测ATP7B基因表达;并以HepG2细胞系作为阳性对照,利用SRB法监测给予不同浓度铜离子处理的干细胞增殖情况。结果:MSCs CD90、CD29表达阳性,CD45、CD11b表达阴性;细胞免疫荧光、Westernblot及RT-PCR显示MSCsATP7B细胞的ATP7B基因能够长期稳定表达;SRB结果显示,高铜环境中MSCsATP7B细胞的生存能力显著高于MSCsGFP细胞及HepG2(P<0.05)。结论:ATP7B基因修正的LEC大鼠MSCs可有效对抗铜蓄积损害,为Wilson病的治疗提供可能的新方法。