白果内酯调控LEF1-AS1/miR-23b-3p分子轴缓解肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞损伤

目的探讨白果内酯对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞损伤的保护作用及其对lncRNA LEF1-AS1/miR-23b-3p分子轴的调控作用。方法用肺炎链球菌诱导肺泡上皮细胞建立细胞损伤模型(感染组);分别转染si-NC、si-LEF1-AS1后,用肺炎链球菌感染细胞(感染+si-NC组和感染+si-LEF1-AS1组);pcDNA、pcDNA-LEF1-AS1分别转染至肺泡上皮细胞后用白果内酯与肺炎链球菌共同处理细胞(感染+白果内酯+pcDNA组和感染+白果内酯+pcDNA-LEF1-AS1组)。ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6的水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;qRT-PCR法检测LEF1-AS1、miR-23b-3p的表达量;双荧光素酶报告基因实验检测LEF1-AS1与miR-23b-3p的靶向关系;Western blot检测Bcl-2、Bax蛋白表达量。结果白果内酯能够降低肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平和LEF1-AS1的表达量(P<0.05),并可降低凋亡率和Bax蛋白水平(P<0.05),还可促进miR-23b-3p和Bcl-2表达(P<0.05),且呈剂量依赖性;LEF1-AS1可靶向调控miR-23b-3p;转染si-LEF1-AS1可降低TNF-α、IL-1β、IL-6的水平以及凋亡率和Bax蛋白水平(P<0.05),增加Bcl-2蛋白水平(P<0.05);转染pcDNA-LEF1-AS1能够逆转白果内酯对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞炎性因子及凋亡的作用。结论白果内酯可通过调控LEF1-AS1/miR-23b-3p分子轴抑制肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞炎性反应及凋亡,进而减轻细胞损伤。

长链非编码RNA LEF1-AS1在老年胃癌病人中的表达及其临床病理意义

目的探讨长链非编码RNA(Long noncoding RNA,LncRNA) LEF1-AS1在胃癌组织中的表达及其临床病理意义。方法应用qRT-PCR技术检测73例胃癌病人(年龄≥65岁)肿瘤组织及癌旁组织中的LncRNA LEF1-AS1表达情况,采用免疫组化法检测胃癌组织样本中PI3K/Akt蛋白表达情况。分析LncRNA LEF1-AS1表达情况与胃癌病人临床病理特征之间的关系及对预后的影响。结果胃癌组织中LncRNA LEF1-AS1的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.01),其表达水平和病人的性别、淋巴结转移情况无关,与组织分化、肿瘤浸润深度(T分期)、TNM分期均有显著相关性(P<0.01)。LncRNA LEF1-AS1表达与胃癌组织中PI3K/Akt的表达呈正相关(P<0.01)。LncRNA LEF1-AS1高表达的胃癌病人无病生存期明显低于低表达组(P<0.05)。结论 LncRNA LEF1-AS1与胃癌的恶性生物学行为关系密切。检测LncRNA LEF1-AS1表达对判断老年胃癌病人预后具有潜在的价值。

敲低LEF1-AS1对胰腺癌细胞的影响

目的:探究淋巴增强因子1反义RNA1(LEF1-AS1)对胰腺癌(PC)细胞的影响及机制。方法:使用Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)网站分析来源于癌症基因组图谱(TCGA)数据库中PC组织和正常胰腺组织LEF1-AS1的表达;取对数生长期的正常人胰管上皮细胞株HPDE和PC细胞株Panc-1、Bxpc-3、As PC-1、Capan-1、CFPAC-1及MIA Pa Ca-2,采用q PCR检测LEF1-AS1在各细胞中的表达;选取q PCR检测后LEF1-AS1表达较高的PC细胞株Panc-1和MIA Pa Ca-2,用si LEF1-AS1与si Control分别转染后分为下调组和对照组,分别采用细胞计数试剂盒(CCK-8)、平板克隆实验、划痕实验和Transwell实验检测敲低LEF1-AS1对各组PC细胞增殖、细胞侵袭及迁移能力的影响,采用Western blot实验检测敲低LEF1-AS1对各组PC细胞中B细胞白血病淋巴瘤2(Bcl-2)、B细胞白血病淋巴瘤相关蛋白(Bax)、钙黏附蛋白E(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)表达的影响。结果:PC组织中LEF1-AS1的表达高于正常组织(P<0.05),Panc-1、Bxpc-3、As PC-1、Capan-1、CFPAC-1及MIA Pa Ca-2细胞中LEF1-AS1表达水平较HPDE细胞上调(P<0.05);下调组Panc-1和MIA Pa Ca-2细胞24 h、48 h和72 h时OD值均较对照组下降,下调组细胞集落形成数较对照组降低(P<0.05);下调组Panc-1和MIA PaCa-2细胞迁移和侵袭能力较对照组细胞降低(P<0.05);敲低LEF1-AS1表达后,下调组Panc-1和MIA Pa Ca-2细胞Bcl-2和Vimentin蛋白的表达量均较与对照组下降,Bax和E-cadherin蛋白的表达量均较与对照组升高(P<0.05)。结论:敲低LEF1-AS1表达后抑制PC细胞的增殖、迁移和侵袭,其机制可能与促进PC细胞的凋亡和抑制上皮细胞-间充质转化进程有关。

家蚕bmo-miR-217对核型多角体病毒(BmNPV)lef-1基因表达的调控作用

昆虫的单链小分子RNA(microRNAs)不仅通过与自身的靶基因互补进行转录后水平调控,从而参与重要的生命过程,并且还可以与病原体靶基因相互作用,在免疫防御方面发挥重要功能。给家蚕5龄眠起幼虫接种家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)后72 h,收集蚕体血淋巴提取总RNA用于高通量测序,经克隆验证获得一条由Bm NPV诱导上调表达的家蚕miRNA(bmo-miR-217),用生物信息学方法预测到bmo-miR-217对应的一个病毒靶基因为lef-1。构建bmo-miR-217及Bm NPV lef-1 3'-UTR的表达载体,并共转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,于48 h后通过检测细胞的双荧光素酶相对活性,显示出bmo-miR-217可显著下调Bm NPV lef-1基因的表达(P<0.05)。已知lef-1是Bm NPV侵染复制的必需基因之一,因此抑制其表达是家蚕先天免疫的一种有效策略。

lncRNA LEF1-AS1通过靶向miR-612调控皮肤鳞状细胞癌细胞株增殖、凋亡、迁移侵袭的体外实验研究

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)LEF1-AS1对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其机制。方法通过干扰皮肤鳞状细胞癌SCC13细胞LEF1-AS1的表达和过表达、抑制miR-612的表达,将SCC13细胞分为转染LEF1-AS1干扰序列、无义序列的干扰LEF1-AS1组、干扰对照组,转染miR-612过表达序列、无义序列的miR-612过表达组、过表达对照组,以及转染LEF1-AS1干扰序列与miR-612抑制序列的干扰抑制组,和转染LEF1-AS1干扰序列与miR-612抑制无义序列的干扰抑制对照组。采用qRT-PCR法检测各组细胞miR-612的相对表达,CCK8法检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞的凋亡情况,Transwell试验检测细胞的迁移、侵袭能力,Western印迹检测细胞周期蛋白依赖激酶1(cyclinD1)、细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂(p21)、Bcl-2家族蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达。用LncBase Predicted v.2在线预测网站预测lncRNA LEF1-AS1与miR-612之间的互补序列,将互补/非互补序列用于构建荧光素酶报告基因质粒,分别与miR-612过表达及过表达对照基因共转染SCC13细胞,验证lncRNA LEF1-AS1与miR-612的结合能力。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果miR-612过表达组细胞增殖能力、迁移及侵袭细胞数均低于过表达对照组(均P<0.05),凋亡率高于过表达对照组(P<0.05)。干扰LEF1-AS1组、干扰对照组、干扰抑制组、干扰抑制对照组miR-612的相对表达差异有统计学意义(F=150.78,P<0.001),24、48、72 h时的增殖能力差异有统计学意义(均P<0.05),凋亡率、迁移及侵袭细胞数差异均有统计学意义(均P<0.05)。干扰LEF1-AS1组细胞中miR-612表达、凋亡率高于干扰对照组,48、72 h细胞增殖能力、迁移细胞数和侵袭细胞数低于干扰对照组(均P<0.05),而干扰抑制组细胞中miR-612表达、细胞凋亡率低于干扰抑制对照组,48、72 h细胞增殖能力、迁移细胞数和侵袭细胞数高于干扰抑制对照组(均P<0.05)。Western印迹显示,4组细胞cyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平差异均有统计学意义(均P<0.001),干扰LEF1-AS1组cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平均高于干扰对照组,p21、Bax蛋白相对水平低于干扰对照组(均P<0.05);而干扰抑制组cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平均高于干扰抑制对照组,p21、Bax蛋白相对水平低于干扰抑制对照组(均P<0.05)。共转染互补序列后,miR-612过表达组细胞荧光活性低于过表达对照组(t=21.19,P<0.001);而共转染非互补序列后,miR-612组细胞荧光活性与过表达对照组差异无统计学意义(t=0.28,P=0.78)。结论lncRNA LEF1-AS1调控皮肤鳞状细胞癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭,机制与靶向miR-612相关。

流体剪切力对成骨细胞LEF-1蛋白表达的影响

目的:探讨MC3T3-E1细胞在流体剪切力作用下LEF-1的表达。方法:通过流体剪切加载系统对MC3T3-E1爬片细胞施加12dyn/cm的流体剪切力,分别作用0h,2h,4h,8h,12h,用RT-PCR方法检测细胞受力前后LEF-1 mRNA表达的变化;应用免疫荧光双标记法检测不同时间点流体剪切力作用下MC3T3-E1细胞中的LEF-1 mRNA表达改变。结果:RT-PCR和免疫荧光双标记法的结果表明12dyn/cm 8h流体剪切力作用下的MC3T3-E1细胞LEF-1 mRNA的表达较其它各组明显增强。结论:通过流体剪切力力学刺激,激活了成骨细胞LEF-1/TCF1转录活动,LEF-1 mRNA的表达增强可能是成骨细胞经典Wnt信号通路对剪切应力的应答反应。

中国棉铃虫单粒包埋核多角体病毒(HaSNPV)HindⅢ-Ⅰ片段的序列分析与基因排列研究

对中国棉铃虫单粒包埋核多角体病毒 (HaSNPV)基因组中的HindⅢ Ⅰ片段的序列进行分析 ,该片段全长75 0 1nt,包括 10个开放阅读框 :AcMNPVORF111的同源基因 (Ac111) ,晚期表达因子 2 (lef 2 )基因 ,病毒核壳结构蛋白 p2 4基因、gp16 基因、多角体包膜蛋白 (polyhedronenvelopeprotein ,pep)基因、AcMNPVORF6 3的同源基因(Ac6 3) ,38 7kD基因 ,晚期表达因子 1(lef 1) 基因 ,及两个特有基因HaSNPV orf5 91和HaSNPV orf435。基因组的排列比较分析发现与AcMNPV有较大区别。