基于CRISPR-Cas9系统构建LEU1基因缺失酿酒酵母用于酿造低醉酒度米酒

为探究酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)异丙基苹果酸合成酶基因LEU1的缺失对酿造米酒生成高级醇的影响,该研究构建重组质粒p414-Cas9-BleoR和p426-gRNA.LEU1-kanMX后电转化酿酒酵母XF0,利用成簇规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR-Cas9)系统构建LEU1基因缺失的酿酒酵母XF0-L。将出发菌株XF0和重组菌株XF0-L进行培养基模拟发酵和米酒发酵,测定发酵酒的理化指标和高级醇含量。结果表明,菌株XF0-L与XF0模拟发酵酒的理化指标无显著差异(P>0.05),说明LEU1基因的缺失对酿酒酵母发酵性能无影响。相较于出发菌株XF0,重组菌株XF0-L模拟发酵酒中正丙醇(26.27 mg/L)和异丁醇含量(88.64 mg/L)分别提高21.96%和85.25%,异戊醇含量(141.82 mg/L)、异戊醇/正丙醇(5.39)、异戊醇/异丁醇(1.60)分别降低15.53%、30.99%、54.42%;相较于出发菌株XF0,重组菌株XF0-L发酵米酒中正丙醇(268.67 mg/L)和异丁醇含量(992.33 mg/L)分别提高14.17%、52.90%,异戊醇含量(1016.33 mg/L)、异戊醇/正丙醇(3.78)、异戊醇/异丁醇(1.02)分别降低13.58%、24.40%、43.65%,说明重组菌株XF0-L能够显著降低发酵酒中的异戊醇/正丙醇、异戊醇/异丁醇从而降低醉酒度(P<0.05)。

LEU1基因缺失对酿酒酵母高级醇生成量的影响

LEU1基因编码异丙基苹果酸合成酶,为了研究该基因对酿酒酵母高级醇生成量的影响,以酿酒酵母AY15单倍体A8为出发菌株,通过构建重组质粒p UC-LABK获得LA-Kan MX-LB重组盒,并利用醋酸锂转化法和同源重组技术,筛选出LEU1基因缺失的突变株A-L9。将突变株和亲本菌株分别进行酒精发酵实验,发酵结束后进行发酵性能和高级醇生成量的测定。两种发酵条件下的实验结果表明,与亲本菌株相比,突变株的正丙醇生成量分别提高了0.18倍和0.47倍,异丁醇的生成量分别提高了0.52倍和1.58倍,而异戊醇的生成量则分别降低了0.29倍和0.51倍。

MCP-1基因-2518A/G与GPx-1基因Pro198Leu多态性的交互作用与非酒精性脂肪性肝病的关系

【目的】探讨单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因-2518A/G与谷胱甘肽过氧化物酶-1(GPx-1)基因Pro198Leu多态性的交互作用及其与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的关系。【方法】采用病例-对照研究的方法,以NAFL、NASH、NAFHC患者及健康对照者各600例的外周血白细胞为样本,利用聚合酶链反应(PCR)技术分析了MCP-1基因-2518A/G和GPx-1基因Pro198Leu多态性。【结果】-2518A/G(GG)基因型和Pro198Leu(LL)基因型频率分布分别为49.67%和49.83%(NAFL组)、63.50%和63.50%(NASH组)、75.17%和75.50%(NAFHC组)及23.50%和23.33%(对照组),上述基因型频率在各病例组与对照组之间有显著差异(P<0.01)。-2518A/G(GG)基因型患NAFLD的风险显著增加(ORNAFL=3.21;ORNASH=5.66;ORNAFHC=9.85)。Pro198Leu(LL)基因型者患NAFLD的风险也显著增加(ORNAFL=3.26;ORNASH=5.72;ORNAFHC=10.13)。基因突变的协同分析发现-2518A/G(GG)/Pro198Leu(LL)基因型者在NAFL、NASH、NAFHC组和对照组中的分布频率分别为39.17%、53.17%、65.33%和12.17%,经χ2检验有统计学差异(P<0.01)。-2518A/G(GG)/Pro198Leu(LL)基因型者患NAFLD的风险显著增加(ORNAFL=5.30;ORNASH=10.91;ORNAFHC=23.92)。-2518A/G(GG)和Pro198Leu(LL)基因型有交互作用(γ1 NAFL=3.50,γ2 NAFL=3.37;γ1 NASH=4.79,γ2 NASH=4.72;γ1 NAFHC=6.19,γ2 NAFHC=5.90)。【结论】-2518A/G(GG和)Pro198Leu(LL)基因型均是NAFLD的易患因素,基因多态性的交互作用增加了NAFLD的发病风险。

GPx-1^(P198L)转基因小鼠模型的建立及鉴定

目的建立系统性高表达含198位点多态性的胞质型谷胱甘肽过氧化物酶(cellular glutathione peroxidase-1,GPx-1)转基因小鼠(GPx-1P198L),为研究GPx-1P198L在氧化应激相关疾病中的作用提供动物模型。方法利用显微注射法将限制性内切酶BamHⅠ和AccⅠ线性化的GPx-1(198Leu)转基因载体注射到C57BL/6J小鼠受精卵中,建立GPx-1P198L转基因小鼠。PCR鉴定实验后小鼠的基因型,Western blot检测GPx-1蛋白表达。结果建立了GPx-1P198L首建鼠13只,筛选后9只原代转基因小鼠能产生子代,其中4只原代转基因小鼠产生的子代(F1代)心脏组织高表达GPx-1蛋白,4只小鼠成功建系。结论建立了系统性表达突变型人GPx-1(198Leu)的转基因小鼠,为研究GPx-1(198Leu)在氧化应激相关疾病中的作用提供了动物模型。