LEU2基因敲除对工业啤酒酵母高级醇生成量的影响

通过敲除啤酒酵母中β-丙基苹果酸脱氢酶基因(LEU2),研究该基因对工业啤酒酵母高级醇特别是异戊醇生成量的影响。通过醋酸锂一步转化法,将一段两端具有LEU2基因序列同源区,中间为遗传霉素(G418)抗性基因的DNA片段转入酵母细胞中,与LEU2基因的ORF(open reading flames)进行同源重组,利用遗传霉素抗性进行筛选。将突变株与出发菌株进行发酵实验,测定其发酵性能和高级醇的生成量。筛选获得了LEU2基因突变的工业啤酒酵母。在支链氨基酸含量较低的培养基中进行发酵测定,突变株发酵液中高级醇含量比出发菌株降低了9.97%,其中异戊醇的含量降低了11.82%,而酒精度、发酵速度等发酵性能没有明显变化。LEU2基因敲除可降低工业啤酒酵母在支链氨基酸含量较低的培养基中高级醇特别是异戊醇的生成量。

YDL080C和LEU2基因敲除对工业黄酒酵母异戊醇生成量的影响

通过敲除生成途径中关键酶的编码基因,对异戊醇在工业黄酒酵母N85中的生成进行了研究。采用融合PCR技术,分别构建类丙酮酸脱羧酶基因(YDL080C)缺失组件"YDL080C-URA3-YDL080C"和β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(LEU2)缺失组件"LEU2-URA3-LEU2",转化工业黄酒酵母N85尿嘧啶缺陷型单倍体Na-u(MATa ura3),获得单倍体工程菌Na-y和Na-l。将转化子与亲本分别进行实验室规模的黄酒发酵实验,结果 YDL080C缺失工程菌的异戊醇含量与亲本相比没有明显变化,说明类丙酮酸脱羧酶不是该途径关键酶;LEU2缺失工程菌的异戊醇含量降低16.16%,说明糖代谢途径存在,但只占小部分,而其他理化指标无明显差异。

拟多形假丝酵母的双营养缺陷型工程化改造及鉴定

目的以拟多形假丝酵母菌（ATCC26012）为材料，构建遗传稳定性良好的尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型工程化菌株。方法利用物化及基因工程等方法对拟多形假丝酵母菌株的染色体进行改造，将ura3基因和leu2基因进行定向诱变，以获得尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型突变菌株，并对其进行生物学鉴定，包括菌株的遗传稳定性、基因序列及生理生化特征分析等。结果筛选得到尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型突变菌株，鉴定结果显示该菌株遗传稳定性良好，标志基因均发生定向改变，生理生化结果显示该菌株能利用多种碳源和氮源，且生长状况良好。结论拟多形假丝酵母的双营养缺陷型工程化改造为进一步研究该菌株的遗传学奠定了基础，为多价蛋白组成类病毒颗粒的外源表达提供了工程化宿主。进而，为复杂疫苗抗原的重组表达和功能研究提供了技术手段。