LGALS1通过MCP-1调节肥胖幼鼠脂代谢的机制研究

分析LGALS1通过MCP-1调节肥胖幼鼠脂代谢的机制。方法 选取8-9周龄C57BL / 6孕小鼠40,小鼠在出生后进行鉴定,断乳后随机分笼,持续给予60%高脂或正常脂肪喂养70d,设置为Lgals1?/? +高脂组,Lgals1?/? +正常脂组,Lgals1+/+ +高脂组,Lgals1+/+ +正常脂组,苦味酸标记,持续给予60%高脂或正常脂肪喂养70d,每3天监测体重并记录。比较各组大鼠临床指标。结果 与Lgals1+/+ +正常脂组相比,Lgals1?/?+高脂组ALT、HDL-C下降、AST、TG、TC、LDL-C指标上升,Lgals1+/++高脂组ALT、HDL-C上升、AST、TG、TC、LDL-C指标下降;Lgals1?/?+正常脂组ALT、HDL-C上升、AST、TG、TC、LDL-C指标下降(P<0.05);与Lgals1+/+ +正常脂组相比,Lgals1?/?+高脂组胰岛素水平、胰岛素指数下降,Lgals1+/++高脂组胰岛素水平、胰岛素指数下降,Lgals1?/?+正常脂组胰岛素水平、胰岛素指数下降(P<0.05);与Lgals1+/+ +正常脂组相比,Lgals1?/?+高脂组LGALS1、FABP4、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT蛋白表达下降,Lgals1+/++高脂组LGALS1、FABP4、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT蛋白表达下降,Lgals1?/?+正常脂组LGALS1、FABP4、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT蛋白表达下降(P<0.05)。结论 LGALS1通过FABP4调节能够促进脂肪细胞增殖和脂质沉积,从而促进肥胖的发生发展,维持机体能量平衡。

山羊睾丸细胞LGALS1基因的克隆及序列分析

为了解山羊LGALS1基因的遗传进化情况,根据NCBI中山羊LGALS1基因序列(登录号:XM_018048739.1)设计1对特异引物,采用RT-PCR技术从山羊睾丸细胞中扩增LGALS1基因,并将其克隆至pMD-19T载体,构建pMD-19T-LGALS1质粒,通过质粒PCR、双酶切和序列测序进行验证,对其核苷酸序列进行比对分析并绘制系统进化树。结果:山羊睾丸细胞LGALS1基因长度为408 bp,编码135个氨基酸。该基因与GenBank中登录的山羊LGALS1编码区序列相似性达100%;与绵羊、羚羊、水牛、牛、人、马、猪、猩猩、虎鲸、猫、驴、大熊猫、家鼠、斑马鱼的核苷酸一致性分别为99.3%、99.0%、97.1%、96.8%、87.3%、87.0%、88.5%、88.5%、90.9%、88.7%、87.0%、86.3%、84.3%、54.6%。系统进化树表明,山羊睾丸细胞LGALS1基因与绵羊、羚羊亲缘关系最近,与斑马鱼亲缘关系最远。结论:试验成功克隆了山羊睾丸细胞的LGALS1基因,不同物种内LGALS1基因高度保守。

兔抗LGALS1蛋白多克隆抗体的制备

为制备兔抗LGALS1蛋白多克隆抗体,将纯化LGALS1蛋白作为抗原,联合弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂免疫新西兰大白兔,经过3次免疫后采集兔血清,采用间接ELISA测定抗血清效价,Western blot检测分析抗体特异性,IFA检测抗体应用效果。结果:血清效价为1∶102 400,Western blot检测可见特异性条带,IFA检测显示细胞质呈特异绿色荧光。结论:试验成功制备了兔抗LGALS1蛋白多克隆抗体,抗体特异性好,效价高。

PRRSV 2b蛋白与LGALS1相互作用的验证研究

旨在研究猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)2b蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用。本研究利用酵母回返试验、GST-pull down试验、免疫共沉淀试验3种方法对LGALS1与PRRSV 2b蛋白间是否相互作用进行验证。结果表明:在酵母回返试验中,含有LGALS1与2b基因的杂交酵母菌株在SD/-Trp-Leu-His-Ade/AbA/X-α-gal的平板上生长出蓝色菌落;在GST-pull down试验中,LGALS1与2b蛋白反应的样品经Western blot可检测到融合蛋白带;在免疫共沉淀试验中,LGALS1与2b蛋白反应的样品经HA单抗沉淀后,经Western blot可检测到相应蛋白带。该研究证明了LGALS1与PRRSV 2b蛋白间发生相互作用,为研究PRRSV感染途径和增殖过程提供了理论基础。

人源肾细胞(HEK293T)蛋白LGALS1真核表达载体的构建

目的:扩增LGALS1、ZFP36L2、WBSCR22三种蛋白的基因,构建其真核表达载体,为后续蛋白互作、毒力因子分析等实验奠定基础。方法:根据毒力蛋白基因序列,使用premier 5.0软件设计了三对特异性引物用于基因扩增。以HEK293T细胞中提取出的RNA反转录出的cDNA为模板,PCR法扩增三种基因LGALS1、ZFP36L2、WBSCR22,连接至pMD19-T载体,构建出pMD19-T-LGALS1、ZFP36L2、WBSCR22,分别经Nde I和BamH I,EcoR I和Nde I,BamH I和EcoR I双酶切后连接到pGBKT7真核表达载体中,构建出pGBKT7-LGALS1、pGBKT7-ZFP36L2、pGBKT7-WBSCR22。结果:目的基因LGALS1、ZFP36L2、WBSCR22扩增成功,pMD19-T-LGALS1、pMD19-T-ZFP36L2、pMD19-T-WBSCR22连接成功,双酶切成功,真核表达载体pGBKT7-LGALS1构建成功,pGBKT7-ZFP36L2、pGBKT7-WBSCR22构建失败。结论:真核表达载体pGBKT7-LGALS1成功构建,为后续实验的进行提供了便利。pGBKT7-ZFP36L2、pGBKT7-WBSCR22构建失败,积累了丰厚的实验经验。

生物信息学分析和预测Galectin-1的靶向作用miRNA分子

目的通过生物信息学软件分析和预测能够靶向结合Galectin-1(LGALS1)的miRNA。方法首先预测能够靶向结合Galectin-1的miRNAs,并对所获得的miRNAs进行计算和分析,获得与Galectin-1结合特异性最强,稳定性最高的miRNA。结果有12个miRNAs可与Galectin-1靶向结合;其中,miR-1827、miR-22与Galectin-1结合的稳定性和特异性均较好。结论 miR-1827、miR-22可能靶向结合于Galectin-1。

抑制差减杂交克隆肺泡发育上游调节基因

肺泡是肺进行气体交换的基本功能单位,但对其发生、发育及调节机制的认识还十分有限。为克隆调节肺泡发生的新基因,我们利用抑制差减杂交技术,以与肺泡发生密切相关的原始肺泡期和肺泡期的小鼠肺为材料,分别相对于肺泡成熟期鼠肺组织构建了两个抑制差减杂交cDNA文库,从中筛选出118个肺泡发生的上游因子。这些基因涉及机体生长发育过程及其调节的多个方面。如可增加内皮细胞渗透性而参与肺血管系统的发生和重建的瞬时受体蛋白(TRPC4),通过刺激平滑肌生长促进肺泡壁毛细血管的发育凝集素(Lgalsl)等。特别是神经元蛋白3．1(亦称P311),因其同时特异表达于原始肺泡期和肺泡期而引起我们的注意。实时PCR进一步显示,P311表达于肺发育的全过程,但表达高峰仅出现于肺泡发育相关阶段,而在成熟肺组织中降至最低点。提示P311可能与肺泡形成密切相关。

猪源A型产气荚膜梭菌β2毒素与宿主细胞互作蛋白的筛选鉴定

产气荚膜梭菌产生的β2毒素在仔猪肠炎中起着重要作用,为研究该毒素侵入宿主细胞的作用机制,本研究以β2为诱饵蛋白,将其与酿酒酵母转录因子GAL4的BD(DNA binding domain)融合表达,利用猪肠上皮细胞系IPEC-1的cDNA文库与GAL4的AD区(Activation domain)融合表达,通过酵母双杂交系统筛选鉴定与β2毒素相互作用的猪肠上皮细胞蛋白。筛选得到的阳性转化子经提取质粒和测序后,比对其所包含的编码蛋白序列,得到4个潜在的与β2毒素存在相互作用的细胞蛋白,分别为S20、LGALS1、L12和Atrophin-1。其中S20、L12和Atrophin-1是位于细胞内的核蛋白,而LGALS1是一种存在于细胞膜外侧的半乳糖凝集素,可能是毒素的作用位点。对LGALS1进行回交验证,结果显示其C端与β2毒素的相互作用强于其完整蛋白与β2毒素的相互作用。本研究结果对研究β2毒素的致病机制奠定了基础。

LGALS1对猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145中复制的影响

为探索LGALS1对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在Marc-145中复制的影响,设置LGALS1免疫血清和PRRSV共同孵育Marc-145细胞的试验组、LGALS1 siRNA转染Marc-145细胞后再接种PRRSV的试验组以及PRRSV直接孵育Marc-145细胞的对照组,利用间接免疫荧光、TCID50测定、荧光定量和Western blot来测定病毒的增殖、滴度变化和表达情况。结果发现,抗LGALS1血清组、转染LGALS1 siRNA质粒组与对照组荧光、TCID50、病毒mRNA和蛋白水平差异均不显著。结果表明,LGALS1对PRRSV在Marc-145中复制无影响。

猪LGALS1基因的原核表达及序列分析

目的原核表达猪源LGALS1并进行序列分析。方法提取猪肺泡巨噬细胞总RNA,RT-PCR法扩增LGALS1的cDNA序列,与pMD18-T载体连接,构建重组克隆质粒pMD18-T-LGALS1并测序,应用生物分析软件对基因序列进行同源性比对及系统进化树分析;将构建正确的质粒pMD18-T-LGALS1亚克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a-LGALS1,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、Ni2+亲和层析纯化后,进行Western blot分析。结果PCR扩增获得了全长为408 bp的cDNA序列,与GenBank中登录的LGALS1编码区序列(NM001001867.1)相似性达99%,核苷酸序列同源性分析表明,克隆基因序列与猪源LGALS1同源性最高;质粒pET-30a-LGALS1经PCR及双酶切鉴定证明构建正确;表达的LGALS1相对分子质量约21000,经纯化后,可与LGALS1 Antibody发生反应,具有反应原性。结论成功表达了猪源LGALS1。

水疱性口炎病毒糖蛋白基因的真核表达及其初步应用

为验证水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)糖蛋白与半乳糖凝集素1(lectin galactoside-binding soluble 1,LGALS1)之间的相互作用,本研究将VSV-G全基因插入至真核表达载体pEF1α-IRES-DsRed-Express2中,构建了真核表达质粒pEF1α-VSV-G。在DNA转染试剂的作用下,将pEF1α-VSV-G转染至BHK-21细胞中,转染后24h经荧光显微镜观察即可见细胞内有红色荧光信号。提取细胞蛋白后经Western-blotting检测,证明VSV-G蛋白成功表达。将表达的蛋白与LGALS1共同用于免疫共沉淀试验,Western-blotting检测结果说明表达的蛋白可以用于蛋白相互作用的研究。本试验为深入开展VSV-G蛋白受体的研究奠定了基础。