LGALS3BP 3’UTR荧光素酶报告基因载体构建及鉴定

目的构建LGALS3BP(lectin,galactoside-binding,soluble,3 binding protein,LGALS3BP)基因3’非编码区(3’-untranslated region,3’UTR)的野生型及突变型荧光素酶报告基因重组载体并进行鉴定,以备进一步研究miRNA对LGALS3BP基因的调控。方法Targetscan软件预测LGALS3BP 3’UTR上的miRNA结合位点;以人肝癌细胞系SMMC-7721基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得野生型LGALS3BP基因3’UTR片段,经双酶切将目的片段定向插入报告基因载体pGL3-Control中,将克隆好的重组载体转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞进行扩增,采用菌落PCR及测序监定重组子。设计位点突变型LGALS3BP 3’UTR扩增引物,以构建的野生型LGALS3BP 3’UTR重组质粒为模板,采用重叠PCR及定点突变PCR技术进行扩增分别构建单独位点及双位点突变型重组荧光素酶报告基因载体。结果野生型LGALS3BP 3’UTR重组质粒经菌落PCR鉴定,可见871 bp的目的基因片段,大小与预期相符;测序结果表明,插入序列与LGALS3BP 3’UTR序列完全一致且插入方向正确。Targetscan软件预测到LGALS3BP 3’UTR区有两个感兴趣的miRNA结合位点。突变型LGALS3BP 3’UTR重组质粒测序鉴定结果表明,单独位点及双位点突变型重组质粒中均成功引入结合位点突变。结论成功构建LGALS3BP的3’UTR野生型(pGL3-LGAL-W-3’UTR)、两个单独位点突变型(pGL3-LGAL-M1-3’UTR和pGL3-LGAL-M2-3’UTR)及双位点突变型(pGL3-LGAL-M-3’UTR)重组荧光素酶报告基因载体,为后续研究miRNA对LGALS3BP基因的调控奠定基础。

miR-4660对肝癌细胞迁移和侵袭的影响及其机制

目的探讨miR-4660对肝癌细胞SK-HEP-1侵袭和迁移的影响及其作用机制。方法利用癌症数据在线分析网站UALCAN分析肿瘤基因组图谱数据库TCGA中肝细胞癌组织中半乳糖凝集素3结合蛋白(LGALS3BP)基因表达,miRNA靶基因预测网站Targetscan在线预测miR-4660与LGALS3BP基因3′非翻译区(3′UTR)的结合关系。利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-4660与LGALS3BP基因之间的调控关系。分别将miR-4660模拟物(mimics)、抑制剂(inhibitor)及其阴性对照(miR-NC)转染至人SK-HEP-1细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)及Western blot检测LGALS3BP基因及PI3K/Akt信号通路蛋白p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt的表达水平。细胞划痕及Transwell实验检测细胞的迁移及侵袭能力。结果UALCAN分析显示,相对于正常组织,在肝细胞癌组织中LGALS3BP显著高表达(P<0.05)。Targetscan预测到,miR-4660在LGALS3BP 3′UTR区有两个结合位点。双荧光报告基因实验显示,miR-4660 mimic组野生型重组载体pGL3-LGAL-W-3′UTR、位点1或位点2单独突变的重组载体(pGL3-LGAL-M1-3′UTR和pGL3-LGAL-M2-3′UTR)的相对荧光素酶活性均低于miR-NC组(P<0.05)。qRT-PCR及Western blot结果显示,miR-4660 mimic组LGALS3BP基因在mRNA及蛋白水平的表达,p-PI3K、p-Akt蛋白的表达均低于未转染组及miR-NC组(P<0.05),miR-4660 inhibitor组上述指标均高于miR-NC组(P<0.05)。细胞划痕及Transwell实验发现,过表达miR-4660后SK-HEP-1细胞的迁移及侵袭能力明显下降(P<0.05)。结论miR-4660通过下调靶基因LGALS3BP的表达进而降低PI3K/Akt信号通路活性,抑制肝癌SK-HEP-1细胞的迁移及侵袭。