1例LHX3基因突变致联合垂体激素缺乏症3型患儿的临床资料及基因检测结果分析

目的通过对1例LHX3基因突变致联合垂体激素缺乏症3型(CPHD3)患儿的临床资料及基因检测信息分析,总结LHX3基因突变致CPHD3的临床特点及遗传学特征。方法对1例LHX3基因突变致CPHD3患儿的临床资料及基因检测信息作回顾性分析。结果患儿,女,11月,因“体质量不增3月,发现肝功异常6天”就诊。患儿出生史正常,查体发现运动发育落后,垂体内分泌功能检测提示患儿存在中枢性甲状腺功能低下、生长激素缺乏、低泌乳素血症,完善垂体MRI检查未发现异常,初步诊断为联合垂体激素缺乏症(CPHD)。取患儿及父母外周血进行全外显子检测,结果显示,患儿存在LHX3基因2号外显子c.247T>A(p.Cys83Ser)杂合变异,来源于父亲;3号外显子c.355_357dupCAC(p.His119dup)杂合变异,来源于母亲。结合基因检测结果,明确诊断为CPHD3。患儿使用优甲乐及生长激素治疗,效果良好。结论CPHD3为罕见遗传病,表现为多种垂体激素缺乏,完善基因检测有助于明确诊断。LHX3基因突变可导致CPHD3,LHX3基因2号外显子c.247T>A(p.Cys83Ser)杂合变异、3号外显子c.355_357dupCAC(p.His119dup)杂合变异为新发现的突变。

三个绵羊品种LHX3基因多态性与生长性状的关联分析

寻找与绵羊生长性状有关的分子标记,以期为绵羊的分子育种提供理论依据。通过琼脂糖凝胶电泳和一代测序技术,在滩羊(TS)、小尾寒羊(STHS)和兰州大尾羊(LFTS)的LHX3基因中检测到了29 bp片段的插入型(AA)、插入/缺失型(AB)以及缺失型(BB)3种基因型,对3个不同品种绵羊的LHX3基因进行遗传多态性分析,并通过一般线性模型分析了3种基因型与3个品种绵羊不同生长性状的相关性。3个品种绵羊LHX3的多态信息含量(PIC)均为0.25<PIC≤0.5,呈中度多态,表明该位点的遗传变异相对较高。LHX3基因型影响3个品种绵羊的一个或多个生长性状,其中LHX3基因型与滩羊的体长(BL)、体重(BW)、胸深(ChD)和管围(CaC)显著相关(P<0.05),且缺失型基因型的生长性状优于插入型基因型和插入/缺失型基因型绵羊;小尾寒羊的缺失型基因型的胸围(ChC)、胸深(ChD)和管围(CaC)显著高于插入型基因型和插入/缺失型基因型绵羊(P<0.01);兰州大尾羊的缺失型基因型的胸围(ChC)、十字部高(HW)、体长(BL)、体重(BW)和管围(CaC)显著高于插入型基因型和插入/缺失型基因型绵羊(P<0.01)。由此可见在绵羊分子育种中,LHX3中29 bp的缺失型可作为绵羊选育的DNA标记位点。

神经生长因子促进海马胆碱能神经再生过程中Lhx8的动态表达

目的探讨神经生长因子(NGF)促进海马胆碱能神经再生与同源盒基因Lhx8之间的关系。方法SD大鼠72只,在制备切割右侧穹隆海马伞模型和NGF侧脑室注射的基础上,分为对照组、切割组、NGF组、切割联合NGF组;Real-time PCR和Western blotting分别检测各组动物海马中Lhx8蛋白的表达变化;免疫荧光技术检测各组动物海马齿状回颗粒下层中胆碱乙酰转移酶(ChAT)/Lhx8双标细胞数。结果切割组和NGF组中Lhx8蛋白的表达量较对照组增高,切割联合NGF组增高更为明显,且Lhx8基因表达也增高;NGF组和切割联合NGF组中海马齿状回颗粒下层(SGZ)中的ChAT/Lhx8双标细胞数也较对照组和切割组明显增多。结论侧脑室注射NGF促进海马胆碱能神经再生与Lhx8的高表达有关。

Lhx8促进海马神经干细胞向胆碱能神经元分化

目的构建大鼠Lhx8全长结构基因真核表达载体。方法 PCR法扩增Lhx8全长结构基因,经EcoRI和BamHI双酶切后连接至真核表达载体pEGFP-C3中,重组质粒pEGFP-C3-Lhx8经测序鉴定后,采用脂质体转染的方法转染至体外培养的海马神经干细胞中。结果测序鉴定表明,重组质粒pEGFP-C3-Lhx8-EGFP构建成功,该重组质粒转入体外培养的神经干细胞后,质粒转染组中ChAT阳性的细胞数较阴性对照组明显增多(P<0.05)。结论重组质粒pEGFP-C3-Lhx8-EGFP构建成功,Lhx8能够促进NSCs向ChAT阳性的细胞分化。

Lhx8在海马胆碱能神经再生中的作用

目的探讨切割穹隆海马伞大鼠海马胆碱能神经再生过程中Lhx8的作用。方法 72只SD大鼠随机分成4组,每组18只。所分的4组分别为:对照组(未做任何处理),切割组(切割右侧穹隆海马伞),过表达组(右侧海马齿状回中注射Lenti6.3-Lhx8慢病毒)及切割联合过表达组(右侧海马齿状回中注射Lenti6.3-Lhx8慢病毒并切割右侧穹隆海马伞)。28d后每组各取6只分别制备脑冷冻切片行免疫荧光检测,提取海马总RNA行Real-time PCR,提取海马蛋白行Western blotting检测。结果与对照组相比,切割组、过表达组和切割联合过表达组中Lhx8 mRNA和蛋白水平均显著上调,以切割联合过表达组中上调最为显著,组间比较差异均有统计学意义;切割组胆碱乙酰转移酶(ChAT)mRNA水平与对照组相比无统计学差异,过表达组和切割联合过表达组中ChAT mRNA显著上调,且以切割联合过表达组中上调最为显著;切割组、过表达组和切割联合过表达组中均检测到ChAT蛋白,组间比较差异有统计学意义;切割组、过表达组和切割联合过表达组海马齿状回门区和颗粒下层中均能检测到新生的Lhx8阳性的胆碱能神经元,且以切割联合过表达组最多,组间比较差异均有统计学意义。结论上调Lhx8的表达能促进海马中神经干细胞向胆碱能神经元分化,Lhx8可能与海马胆碱能神经再生有关。

同源盒LHX4基因在成年中枢神经组织的表达

通过MTEarray分析 72种人不同组织中LHX4基因mRNA的表达 ,发现LHX4基因不仅在胚胎的中枢神经系统表达 ,也在成年的中枢神经系统保持着低水平表达。通过原位杂交的方法发现LHX4基因在成年动物脊髓腹侧的运动神经元和大脑皮层特异性表达 ,提示该基因可能在成年中枢神经系统 ,特别是在脊髓运动神经元中发挥作用。

Lhx8基因沉默抑制NGF诱导的海马NSCs向胆碱能神经元分化的研究

目的:明确Lhx8在神经生长因子(nerve growth factors,NGF)促进海马神经干细胞向胆碱能神经元分化中的作用。方法:体外培养海马神经干细胞并应用NGF促进其向胆碱能神经元分化的过程中,将构建的Lhx8干扰慢病毒加入至培养液中,7 d后应用免疫荧光标记技术检测分化所得胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,Ch AT)和微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)双标阳性细胞。结果:在空白对照组中,仅检测到少量的Ch AT/MAP-2双标阳性细胞;在NGF组或是NGF联合阴性对照慢病毒组中则可检测到较多的Ch AT/MAP-2双标阳性细胞;在加入Lhx8干扰慢病毒的实验组中,分化所得的Ch AT/MAP-2双标阳性细胞数较NGF组或是NGF联合阴性慢病毒组明显减少。结论:Lhx8基因沉默抑制了NGF诱导的海马神经干细胞向胆碱能神经元的分化。

陕北白绒山羊Lhx2基因cDNA序列的克隆与原核表达

根据GenBank中已发表的Lhx2基因序列设计引物,采用RT-PCR方法,从陕北白绒山羊皮肤组织克隆Lhx2基因编码区cDNA,对其进行生物信息学分析,并构建原核表达载体pET-Lhx2,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。最终获得陕北白绒山羊Lhx2基因,长1 221bp;酶切和测序结果显示,原核表达载体pET-Lhx2构建成功;SDS-PAGE和Western blot分析表明,重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出目的融合蛋白。

miR-409-3p通过抑制LHX2调控VEGF/VEGFR2信号通路促进前列腺癌细胞凋亡、抑制细胞增殖

目的:探讨微小RNA-409-3p(microRNA-409-3p,miR-409-3p)对前列腺癌细胞增殖、凋亡的影响及其分子机制。方法:qRT-PCR与Western blot平行检测前列腺癌细胞中miR-409-3p与LIM同源框基因2(LIM-homeobox gene 2,LHX2)的表达;CCK-8实验检测miR-409-3p过表达对前列腺癌细胞增殖能力的影响,以及LHX2过表达对前列腺癌细胞增殖能力的恢复作用;流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告基因检测miR-409-3p与LHX2的靶向作用关系;Western blot检测细胞中LHX2、CyclinD1、CDK4、Cleaved-caspase-3及VEGF/VEGFR2信号通路相关蛋白表达。结果:miR-409-3p在前列腺癌细胞中的表达水平显著低于正常前列腺上皮细胞(P<0.05),LHX2的表达水平高于正常前列腺上皮细胞(P<0.05);miR-409-3p过表达可显著抑制前列腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡(P<0.05),并可上调Cleaved-caspase-3的表达(P<0.05),下调CyclinD1、CDK4、VEGF、t-VEGFR2、p-VEGFR2的表达(P<0.05);双荧光素酶实验证明miR-409-3p与LHX2存在靶向关系,miR-409-3p可负性调控LHX2的表达;LHX2过表达可部分逆转miR-409-3p对前列腺癌细胞增殖、凋亡及VEGF/VEGFR2信号通路的影响。结论:miR-409-3p可通过下调LHX2的表达而促进前列腺癌细胞凋亡、抑制细胞增殖,其作用机制可能与抑制VEGF/VEGFR2信号通路激活有关。

繁殖候选基因Lhx8的真核表达和定位分析

从猪卵巢组织中提取总RNA为模板,采用RT-PCR方法获得了猪Lhx8基因的完整开放阅读框,将该基因克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,经酶切分析和测序证明成功构建了真核重组质粒pEGFP-N1-Lhx8。将成功构建的pEGFP-N1-Lhx8分别转染猪肾细胞PK-15和猪颗粒细胞(GCs),转染后48 h,通过荧光显微镜观察对猪Lhx8基因在这2种细胞中的定位特点进行分析。结果显示:绿色荧光呈点状分布,根据绿色荧光分布的位置,推测Lhx8蛋白很可能位于细胞核中。

结肠癌细胞系LHX6基因启动子甲基化检测与分析

为探讨结肠癌细胞SW480和HT-29中LHX6基因启动子区CpG岛的甲基化状态,分析去甲基化与结肠癌细胞增殖的关系,用甲基化特异性PCR对SW480和HT-29细胞的LHX6基因启动子区域CpG岛进行检测,对比经5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)处理后两株细胞该区域甲基化水平之间的差异,用(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,噻唑蓝)(MTT)法检测5-Aza-CdR对其增殖的影响,观察5-Aza-CdR对细胞形态的影响.结果表明,SW480与HT-29细胞的LHX6基因启动子区域CpG岛均存在甲基化,分别为41.9%和28.6%;经5-Aza-CdR处理后,SW480甲基化率由41.4%降低到39.7%,HT-29甲基化率由27.4%降低至18.5%(p<0.05);两株细胞的增殖明显被抑制.结肠癌细胞系SW480和HT-29的LHX6基因均存在不同程度的甲基化,研究结果为LHX6可能作为结肠癌肿瘤检测的新分子靶标奠定基础.

LHX3基因调控Sonic hedgehog信号通路影响原发性肝癌发生和发展的研究

目的探究LHX3基因在原发性肝癌(以下简称肝癌)发生和发展中的作用及机制。方法收集2017年1月至2019年1月在泸州市中医医院接受手术治疗的54例肝癌患者的肿瘤组织及癌旁组织(距肿瘤边缘>3 cm),采用免疫组织化学染色法检测组织中LHX3表达水平。将HepG2细胞随机分为空白对照组(正常培养细胞)、NC-shRNA组(转染阴性对照NC-shRNA慢病毒质粒)、LHX3-shRNA组(转染LHX3-shRNA慢病毒质粒)和LHX3-shRNA+Pur组(转染LHX3-shRNA慢病毒质粒后用Purmorphamine试剂处理24 h)。采用实时荧光定量PCR(real-time qPCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)检测细胞中LHX3表达水平,Western blotting法检测Sonic hedgehog(Shh)信号通路相关蛋白Shh、Gli-l的表达,CCK-8法检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力。选取30只SPF级雌性BALB/c裸鼠随机分为对照组、NC-shRNA组和LHX3-shRNA组,分别接种空白对照组、NC-shRNA组和LHX3-shRNA组HepG2细胞,以构建移植瘤裸鼠模型。在接种后第21天处死裸鼠,采用H-E、TUNEL染色法观察各组肿瘤组织的病理变化,免疫组织化学染色法检测Gli-l表达,Western blotting法检测Shh、Gli-l蛋白表达。结果肝癌患者肿瘤组织中LHX3阳性表达率较癌旁组织显著升高(P<0.05)。与空白对照组比较,沉默LHX3表达的LHX3-shRNA组HepG2细胞中LHX3 mRNA和蛋白相对表达量均显著下降(P均<0.05),Shh、Gli-l蛋白相对表达量均显著下降(P<0.05),细胞增殖能力显著减弱(P<0.05),细胞侵袭数量与迁移数量均显著减少(P均<0.05)。与LHX3-shRNA组比较,LHX3-shRNA+Pur组细胞的增殖能力显著增强(P<0.05),细胞侵袭数量与迁移数量均显著增加(P均<0.05)。与对照组比较,LHX3-shRNA组裸鼠肿瘤组织体积显著减小、湿重显著降低(P均<0.05),肿瘤组织细胞密度降低,细胞凋亡率显著升高(P<0.05),Shh和Gli-l蛋白相对表达量均显著下降(P均<0.05),Gli-l蛋白阳性表达率显著下降(P<0.05)。结论LHX3在肝癌组织中呈高表达,沉默LHX3表达可抑制HepG2细胞的增殖、侵袭和迁移,并可抑制肿瘤生长,其机制可能与调控Shh信号通路有关。

LHX6基因在肺癌中的甲基化及表达

目的分析LHX6基因在肺癌组织和肺癌细胞系中的甲基化情况及其表达,并初步探索LHX6基因生物学功能。方法采用甲基化特异性PCR(MSP)方法对88例配对肺癌患者肺癌组织和癌旁正常组织以及肺癌细胞系中LHX6基因甲基化情况进行检测;应用RT-PCR,qPCR和免疫组化方法对正常肺组织、肺癌组织、癌旁组织和肺癌细胞系中的LHX6基因mRNA和蛋白表达情况进行检测;对LHX6基因过表达处理检测该基因对肿瘤细胞的生长、增殖影响探索其生物学功能。结果 LHX6基因在肺癌组织与肺癌细胞系中发生明显高甲基化(P<0.01),且该基因在肺癌组织和肺癌细胞系中呈现了表达下降情况(P<0.01)。过表达LHX6基因后可以明显抑制肿瘤细胞的生长和增殖。结论 LHX6基因在肺癌中是一个受甲基化调控的基因,该甲基化程度影响该基因表达,该基因具有抑制肺癌的作用,是一个典型的抑癌基因。

切割穹窿海马伞后海马齿状回内Lhx8的表达变化及其对RGCs向胆碱能神经元分化的影响

目的:明确Lhx8在SD大鼠切割穹窿海马伞后海马齿状回颗粒下层和门区中的表达变化。方法:切割SD大鼠穹窿海马伞,成功制备海马去神经支配动物模型后,通过Western Blot的方法检测切割后第1、3、7、14、21、28 d海马中Lhx8蛋白的表达变化;通过免疫组织化学方法检测切割后第7天海马齿状回颗粒下层和门区中Lhx8阳性细胞的表达定位,并通过免疫荧光化学方法检测Lhx8/ChAT双标阳性细胞的共定位情况;切割SD大鼠穹窿海马伞并制备海马提取液,将其加入至细胞培养液中,模拟体内海马神经再生微环境,检测培养的海马放射状胶质细胞(radial slia cells,RGCs)向胆碱能神经元分化的情况。结果:切割穹窿海马伞后第7 d,Lhx8蛋白表达量较其他各时相点明显增高;海马齿状回颗粒下层和门区中Lhx8阳性细胞数目和光密度也明显高于正常侧,Lhx8/ChAT双标阳性细胞数目也较正常侧增多;体外细胞培养,切割穹窿海马伞侧海马提取液也较正常侧海马提取液更能促进海马放射状胶质细胞向胆碱能神经元的分化。结论:切割穹窿海马伞后,Lhx8表达明显上调,与海马齿状回的胆碱能神经再生有关。

人同源框基因Lhx4 cDNA序列的获得,染色体定位和基因组分析

Lhx4基因是LIM同源框基因家族的一员 ,它在运动神经元的发育过程中发挥着重要的作用 .从人脊髓cDNA文库中筛选到了 1个人源性Lhx4基因的cDNA全长序列 ,它与鼠源性的Lhx4基因的cDNA序列有 92 %同源性 .它的基因被定位在 1号染色体 1q 2 4 .1- 1q 2 4 .3的位置 ,并包含有 6个外显子 .其中同源框结构域由外显子 4和 5表达 ,LIM结构域 1由外显子 2表达 ,LIM结构域2由外显子 3表达 .

LHX6基因抑制肺腺癌的转移机制

目的探究LHX6基因在抑制肺腺癌转移过程中的具体机制及临床意义。方法利用公共数据库分析LHX6基因表达水平对不同病理类型肺癌预后及转移的相关性及可能的信号通路,采用体内差异表达肿瘤细胞模型和体外裸鼠皮下成瘤模型,评价LHX6基因抑制肺腺癌转移的作用;利用Western Bolt、Top/Fop、Flash、荧光素酶报告实验对LHX6基因抑制肺腺癌转移的具体机制进行研究。结果 LHX6基因在体外实验和体内实验均能抑制肺腺癌细胞的增殖和转移,该基因抑制肺腺癌转移的具体机制为转录沉默Wnt/β-连环蛋白通路抑制了Wnt/β-连环蛋白,LHX6基因表达情况与肺腺癌患者临床结局和远处转移明显相关。结论 LHX6基因对肺腺癌细胞增殖和迁移有明显的抑制作用,其主要通过转录沉默Wnt/β-连环蛋白通路而抑制肺腺癌细胞的增殖和转移,且该基因表达水平与肺腺癌患者临床预后和远处转移明显相关。

猪繁殖候选基因Lhx8的原核表达及条件优化

以猪卵巢组织的总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增猪Lhx8基因完整的开发阅读框,将该基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建了原核重组质粒pET28a(+)-Lhx8。将重组质粒转化Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导表达及SDS-PAGE检测后,发现1条特异的蛋白表达条带,分子量为37 kD左右。通过对IPTG浓度和诱导时间的优化,结果显示融合蛋白的最佳诱导浓度为0.4 mmol/L IPTG,最佳诱导时间为37℃诱导12h。

陕北白绒山羊Lhx2毛囊表达载体构建及转染成纤维细胞的研究

以陕北白绒山羊毛囊生长期皮肤组织cDNA为模板,扩增出Lhx2基因的CDS区,成功构建了以KAP6.1为启动子表达Lhx2基因的绿色荧光表达载体pIRES2-KAP-LHX-EGFP.并利用脂质体介导转染绒山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得了稳定转染的细胞系,经PCR检测显示外源基因已整合到细胞基因中.研究结果为进一步开展Lhx2基因对绒山羊毛囊发育的影响和转Lhx2基因绒山羊的生产提供了前期研究基础.

LHX6基因在肝癌转移中的作用机制及临床预后意义

目的通过对肝癌切片免疫组化研究观察侵袭指标的表达状况,体外培养人肝癌细胞株Hep G2,利用细胞建立肝癌动物模型,通过上调和下调LHX6基因表达,观察LHX6对肝癌细胞黏附、迁移能力以及肿瘤形成的影响。方法对肝癌标本切片进行免疫组织化学染色,观察各项指标的表达情况以及相关性。设计LHX6特异性引物,分别用质粒转染及si RNA转染上调和下调体外培养的人肝癌细胞株Hep G2中LHX6基因表达水平,通过RT-PCR法检测LHX6基因相对表达量,MTT法检测肝癌细胞体外增殖能力,细胞划痕实验检测肝癌细胞体外迁移侵袭能力。制备LHX6稳定高/低表达的肝癌细胞株,建立原位和皮下肝癌动物模型,观察瘤块大小、皮下浸润、远处转移和腹腔播散情况,记录皮下肿瘤生长曲线。结果 LHX6基因的表达与E-cadherin的表达呈正相关,与Vimentin、Snail的表达呈负相关。质粒转染可以上调LHX6表达,抑制肝癌细胞体外黏附、迁徙、侵袭、克隆形成;而si RNA转染可以下调LHX6表达,促进肝癌细胞体外黏附、迁徙、侵袭、克隆形成。低表达LHX6可以促进肿瘤的发生转移,而高表达LHX6可以抑制肿瘤的发生转移。结论 LHX6基因、E-Cadherin的高表达与Vimentin、Snail的低表达是促进肝癌预后的保护因素。高表达LHX6可以抑制肝癌细胞的增殖和转移,而低表达LHX6可以促进肝癌细胞的增殖和转移,两者呈负相关关系。这对于肝癌靶向治疗和临床预后具有重要的指导意义。

慢病毒介导的Lhx8基因过表达在海马胆碱能神经元发生中所起作用的初步研究

目的:明确Lhx8过表达慢病毒在海马齿状回胆碱能神经元发生中的作用。方法:构建Lhx8过表达重组质粒、进行慢病毒包装,通过颅脑立体定位和微量注射的方法,将所得慢病毒Lenti6.3-Lhx8注入SD大鼠海马齿状回中;于注射后第1、3、7、10、14天在激光共聚焦显微镜下直接观察增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的荧光表达;检测术后第7天时EGFP/Lhx8/ChAT三标阳性细胞的数目。结果:慢病毒注射后第3天,海马齿状回中EGFP绿色荧光信号最强;此后EGFP表达下降,注射后第14天,几乎检测不到EGFP阳性细胞;术后第7天,注射Lenti6.3-Lhx8的慢病毒侧海马齿状回门区内能够检测到EGFP/Lhx8/ChAT三标阳性细胞,与阴性对照侧比较明显增多。结论:海马齿状回内注射Lhx8过表达慢病毒能够促进胆碱能神经元的发生。