人LIGHT基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的 克隆人ＬＩＧＨＴ基因，构建其重组腺病毒载体，以研究ＬＩＧＨＴ过表达与腺病毒感染对细胞生长的影响。方法用ＲＴ－ＰＣＲ法从人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中克隆人的ＬＩＧＨＴ全长基因。将ＬＩＧＨＴ ｃＤＮＡ克隆到穿棱载体ｐＡｄＴｒａｃｋ－ＣＭＶ－ＬＩＧＨＴ重组质粒中，经酶切线性化后，将重组质粒ｐＡｄＴｒａｃｋ－ＣＭＶ－ＬＩＧＨＴ和骨架质粒ｐＡｄＥａｓｙ－１，以电穿孔法共转染大肠杆菌ＢＪ５１８３，获得重组腺病毒质粒。最后，将线性化的重组腺病毒质粒转染２９３细胞包装获得重组腺病毒，用荧光显微镜、ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析ＬＩＧＨＴ基因的表达。 结果 用ＲＴ－ＰＣＲ法从人的ＰＢＭＣ中，扩增出７２３ ｂｐ的ｃＤＮＡ，测序证实为人ＬＩＧＨＴ基因。荧光显微镜、ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证实，ＬＩＧＨＴ重组腺病毒可感染２９３细胞，并在２９３细胞内进行有效的复制。结论成功地克隆了人ＬＩＧＨＴ基因，并构建了其重组腺病毒载体，为进一步研究ＬＩＧＨＴ基因的功能提供了条件。

苦参碱对K562细胞LIGHT基因表达的影响

[目的]利用凋亡相关基因芯片研究苦参碱对K562细胞基因表达谱的影响,以揭示苦参碱抗肿瘤作用的分子机制。[方法]苦参碱0.4mg/ml作用K562细胞48h后,分别提取对照组和处理组细胞总RNA,采用Superarray公司GEArrayQSeriesHumanApoptosisGeneArray(HS-002)芯片(含96个凋亡相关基因)筛选出苦参碱作用细胞后的差异表达基因,并用RT-PCR验证其中的LIGHT基因表达的变化。[结果]0.4mg/ml苦参碱作用K562细胞48h后,芯片结果显示37个基因的差异表达在2倍以上,其中表达下调为32个,表达上调为5个。RT-PCR验证了苦参碱对LIGHT基因表达上调的影响。[结论]苦参碱作用K562细胞可上调LIGHT基因的表达。

人LIGHT基因重组慢病毒的构建以及在脐血间质干细胞中的表达

目的构建带有人LIGHT基因的慢病毒载体,观察其在人脐血间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应从PCD DNA-LIGHI、质粒中获得人LIGHT基因,利用infusion技术重组构建慢病毒载体质粒pGC-FU-LIGHT,在脂质体lipofectamine 2000介导下与结构质粒pHelper1.0及包膜蛋白质粒pHelper2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒。将人脐血间质干细胞分为实验组(pGC-FU-LIGHT)、空载体对照组(pGC-FU-EGFP)及空白组(脐血间质干细胞),分别用重组慢病毒、空载慢病毒、PBS感染后,采用RT-PCR以及Elisa检测IIGHT表达情况。结果所获LIGHT基因经测序后与Gene Bank报道序列完全一致;重组慢病毒载体质粒pGC-FU-LIGHT经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107TUJ/L,感染UJCBMSCs后RT-PCR、Elisa检测各组细胞均有LIGHT的表达,其中试验组pGC-FU-LIGHT组更大最表达LIGHT,与其余2组(pGC-FU-EGFP、UJCBMSCs)比较差异具有统计学意义。结论成功构建带有LIGHT基因的慢病毒载体并实现在脐血间质干细胞中的表达,为间充质干细胞移植治疗胃癌的应用奠定了基础。

LIGHT基因的克隆及其可溶性表达

目的 克隆LIGHT基因 ,构建含有人LIGHT基因的表达载体 ,诱导其在大肠杆菌中可溶性表达 ,并对表达的LIGHT蛋白的生物学活性进行检测。方法 从人的外周血单个核细胞中克隆LIGHT全长cDNA及其胞外区片段 ,并将其胞外区片段亚克隆至原核表达载体pET 11a中 ,筛选阳性重组质粒pET LIGHT ,以IPTG诱导其可溶性表达 ,并以SDS PAGE和Westernblot检测进行分析。表达的蛋白初步纯化后 ,进行生物学活性分析。结果 RT PCR扩增出了LIGHT全长 72 3bp的cDNA。SDS PAGE和Westernblot分析证实重组pET LIGHT质粒可表达出相对分子质量 (Mr)为 19× 10 3的蛋白。可溶性LIGHT重组蛋白可共刺激T细胞的增殖及诱导IFN γ的产生。结论 本实验成功地将LIGHT胞外区片段在大肠杆菌中进行表达 ,表达的蛋白具有生物学功能 。

人LIGHT胞外区基因的克隆及融合蛋白的表达

目的:克隆人LIGHT胞外区基因(hsLIGHT),构建其原核表达质粒,并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法:采用RT-PCR方法从HL60细胞中扩增hsLIGHT,将其克隆入原核表达质粒pGEX-4T-2,构建其重组表达质粒pGEX-4T- 2/hsLIGHT,以不同浓度IPTG诱导表达,于不同时间经SDS-PAGE和Western blot分析、鉴定。结果:经RT-PCR扩增获得的 hsLIGHT序列与Genebank报道的LIGHT基因胞外区序列完全一致;SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出相对分子量为47 000的蛋白,与GST-hsLIGHT融合蛋白分子量一致。结论:成功完成了人LIGHT胞外区基因的克隆及其原核表达质粒的构建,在大肠杆菌E．coli BL21中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST-hsLIGHT,为进一步探讨LIGHT的抗肿瘤生物学活性、探索肿瘤免疫治疗新方法奠定了基础。

LIGHT基因和干扰素-γ转染诱导肝癌HepG2细胞凋亡的研究

目的探讨脂质体介导LIGHT基因和IFN-γ转染诱导肝癌HepG2细胞的促凋亡作用。方法以脂质体介导LIGHT基因和IFN-γ转染肝癌HepG2细胞，设立转染组（单转、联合转染组）和对照组（未转染组）。分别于转染后12、24、48h检测肝癌HepG2细胞的凋亡率、Bcl-2及Caspase-8的表达量，并采用方差分析。结果（1）细胞凋亡率：单转组转染后12、24、48h为18．8％±3．5％、25．7％±2．8％、36．4％±3．6％；联合转染组为23．8％±2．4％、31．1％±2．1％、42．5％±4．5％；对照组为8．7％±2．1％、9．3％±1．6％、10．9％±1．2％。3组比较差异有统计学意义（F=15．69，53．33，48．28，P〈0．01）。（2）Bcl-2表达量：单转组在转染后12、24、48h为16．4％±5．0％、13．4％±3．5％、8．6％±2．3％；联合转染组为14．7％±3．8％、9．1％±2．0％、4．6％±2．0％；对照组为25．3％±6．3％、19．8％±4．4％、10．1％±3．8％。3组比较差异有统计学意义（F=6．19，12．29，5．81，P〈0．05）。（3）Caspase-8表达量：单转组在转染后12、24、48h为19．3％±2．4％、27．2％±1．9％、33．7％±3．0％；联合转染组为22．7％±2．2％、30．9％±3．1％、38．2％±3．2％；对照组为1．2％±0．8％、1．8％±0．6％、3．2％±1．5％。3组比较差异有统计学意义（F=71．54，112．78，101．61，P〈0．01）。结论LIGHT基因转染肝癌HepG2细胞后通过调节Bcl-2及Caspase-8的表达来发挥促凋亡作用，IFN-1能增强LIGHT基因诱导肝癌HepG2细胞的凋亡。

LIGHT、IFN-γ基因转染人肝癌HepG2细胞凋亡及其Caspase-3和survivin表达

目的观察LIGHT、IFN-γ基因转染人肝癌细胞HepG2的凋亡及其Caspase-3和survivin的表达变化。方法用LIGHT、IFN-γ真核细胞表达质粒pcDNA4C-LIGHT-cDNA、pcDNA4C-IFN-γ-cDNA及其转化的E.coliJM-109感受态大肠杆菌,经质粒提取后,转染人肝癌细胞HepG2,同时设对照组(未转染)。分别于转染后12、24、48 h收集HepG2细胞。流式细胞仪检测细胞凋亡和Caspase-3、survivin。结果转染后细胞凋亡及Caspase-3表达量在对照组、LIGHT单转组、联合转染组呈逐渐递增趋势,survivin表达量呈递减趋势。结论LIGHT转染后能通过调节HepG2细胞Caspase-3及survivin的表达来发挥促细胞凋亡作用,INF-γ能增强LIGHT诱导的HepG2细胞凋亡,且显著上调其Caspase-3的表达。

香烟烟雾提取物对人支气管上皮细胞中LIGHT及其受体基因表达的影响

目的观察香烟烟雾提取物(CSE)对人支气管上皮细胞16HBE中肿瘤坏死因子超家族成员14(LIGHT)及其受体LTβR和HVEM基因表达的影响。方法将体外培养的16HBE细胞分为干预组和对照组,干预组分别加1%、2%、3%、4%、5%CSE培养48 h,或以3%CSE分别培养6、12、24、36、48 h;对照组加同样体积的无血清DMEM处理。收集对照组和干预组不同浓度和不同作用时点的细胞,采用real-time PCR法检测LIGHT、LTβR、HVEM mRNA。结果与对照组比较,干预组CSE作用16HBE细胞48 h后LIGHT LTβR mRNA表达升高,分别于3%~5%、2%~5%CSE时差异有统计学意义(P均<0.05);干预组1%~4%CSE作用16HBE细胞48 h后HVEM mRNA表达升高(P均<0.05),3%CSE时到达峰值,5%CSE时HVEM mRNA表达较对照组降低(P<0.05)。与对照组比较,3%CSE作用16HBE细胞后各时点LIGHT、LTβR mRNA表达逐渐升高,分别于36、48 h和24、36、48 h时差异有统计学意义(P均<0.05);3%CSE作用16HBE细胞48 h时HVEM mRNA表达升高(P<0.01),其余时点表达变化不显著。结论随着CSE浓度升高和作用时间延长,可引起16HBE细胞LIGHT、LTβR、HVEM基因表达的改变。

LIGHT:一个新的TNF超家族成员

肿瘤坏死因子超家族成员可诱导多种生物学效应 ,包括细胞的生长、分化以及死亡。其家族成员在炎症反应的调节、对感染的免疫反应以及组织的自稳态中都起到了重要的作用。近年来发现了不少新的TNF超家族成员 ,LIGHT是其中具有特殊作用的成员之一 ,它在诱导一些肿瘤细胞凋亡的同时 ,对T细胞的活化也具有特殊的作用 ,可通过树突状细胞 (DC)而诱导抗原特异性的CTL反应 ,有望用于肿瘤临床的免疫治疗。

转基因LIGHT的人脐血间质干细胞对胃癌抑制杀伤作用的研究

目的探讨转基因LIGHT脐血间质干细胞对胃癌的抑制杀伤作用。方法采用慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-LIGHT．在脂质体Lipofectamine2000介导下与结构质粒pHelper1．0和包膜质粒pHelper2．0共转染293T细胞获得慢病毒后分别感染人脐血间质干细胞．获得重组慢病毒感染的脐血间质干细胞（MSC-LIGHT）和空载体慢病毒感染的脐血间质干细胞（MSC）。人胃癌细胞SGC-7901注射到裸鼠腹股沟皮下建立胃癌移植瘤裸鼠模型。荷瘤裸鼠分为MSC-LIGHT组、MSC组和生理盐水组，每组5只，向3组裸鼠瘤周分别注射MSC-LIGHT、MSC及生理盐水。隔日1次，注射3次，第4周取材，观察注射前后瘤体生长情况。反转录PCR和ELISA法测定3组胃癌组织中LIGHT的mRNA和蛋白表达；病理切片观察瘤体的坏死面积。结果MSC．LIGHT组、MSC组和生理盐水组裸鼠肿瘤体积分别为（0．45±0．25）cm3、（0．64±0．36）cm3和（1．21±0．79）cm3，3组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。3组LIGHTmRNA相对表达量分别为2．96±0．27，1．23±0．47和0．73±0．10．蛋白浓度分别为（167．89±2．31）、（73．22±5．74）和（49．66±5．25）ng／L；3组比较差异均有统计学意义（均P〈0．01）。病理切片显示MSC-LIGHT组坏死面积最大。结论转基因脐血间质干细胞旁分泌LIGHT对胃癌细胞具有明显的抑制杀伤作用。