天然免疫分子LILRA1和LILRB2结合并调控HLA—B27的比较性研究

目的：探讨天然免疫分子LILRA1，LILRB2与HLA-1类抗原HLA-B27的结合及其调控作用机制。方法：构建LILRA1，LILRB2的真核表达载体和慢病毒载体，利用流式细胞术检测LILRA1，LILRB2在293T细胞系和221-B27细胞系中的表达，利用HLA—B27同源四聚体检测表达在细胞膜表面的LILRA1，LILRB2与HLA—B27分子结合能力，将LILRA1，LILRB2慢病毒载体分别转入HLA—B27稳定转染221细胞后，通过特异性抗体HC10和W6／32检测HLA—B27表达的差异性。结果：测序结果表明LILRA1与LILRB2载体序列正确，LILRA1与LILRB2均能特异性结合HLA—B27同源四聚体，而LILRB2结合HLA—B27能力强于LILRA1；LILRB2稳定转梁的221-B27细胞中HLA—B27分子在细胞膜的表达降低，而L1LRA1的转染对HLA—B27分子在细胞膜的表达无显著性影响。结论：LILRA1，LILRB2均可在细胞膜表面特异的与HLA-B27同源四聚体相结合，LILRB2在细胞内的高表达将抑制HLA—B27分子在细胞膜的表达。

免疫抑制性受体LILRB2促进新型冠状病毒刺突蛋白介导的炎症过程

目的·探究免疫抑制性受体白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员2(leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 2,LILRB2)在新型冠状(新冠)病毒感染所导致的免疫细胞炎症因子释放中的作用及机制,为新冠病毒肺炎治疗提供潜在靶点。方法·收集包含刺突蛋白胞外段(S-ECD)的细胞上清液,分别使用Western blotting及流式细胞术检测上清液中蛋白表达情况及活性;通过流式细胞术及免疫共沉淀技术检测该上清液中S-ECD与LILRB2的结合;用刺突蛋白处理人单核细胞系THP1或人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),24 h后收集细胞,使用实时定量PCR技术检测相关炎症因子基因mRNA水平改变,同时使用酶联免疫吸附法检测细胞培养液中白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)及IL-1β含量;将si LILRB2通过Lipofectamine 3000试剂转染至人外周血CD33~+髓系细胞中,24 h后使用流式细胞术检测基因干扰效果;在对照组及LILRB2敲低的CD33~+髓系细胞中加入刺突蛋白培养24 h,使用酶联免疫吸附试剂盒检测细胞培养液中IL-6的含量变化。结果·实验成功构建可分泌具有生物活性的新冠病毒S-ECD的293T细胞转染体系;免疫共沉淀实验显示刺突蛋白与LILRB2蛋白存在相互作用,且流式细胞术结果提示刺突蛋白胞外段能够与细胞表面的LILRB2结合;与对照组相比,经刺突蛋白处理24 h的THP1细胞中IL-6、IL-8、精氨酸酶(arginase 1)及IL-2基因表达水平均有明显上调(均P<0.05);PBMC经刺突蛋白处理24 h后,IL-6、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、IL-8、IL-10及IL-1β的mRNA水平均显著上升(均P<0.05);酶联免疫吸附实验结果显示,在PBMC培养液中加入刺突蛋白能够提高上清液中IL-6及IL-1β的浓度(均P<0.05);使用S-ECD或刺突蛋白处理CD33~+髓系细胞,IL-1β及IL-6含量随之升高(均P<0.05);并且过表达LILRB2的THP1细胞经刺突蛋白刺激后展现了更强的IL-6分泌能力(P<0.05);流式细胞术检测结果显示,2条siRNA均能敲低CD33~+髓系细胞中的LILRB2,且si LILRB2-1敲除效果更好;LILRB2缺失后,刺突蛋白则不能促进CD33~+髓系细胞的IL-6分泌。结论·新冠病毒刺突蛋白通过与细胞表面分子LILRB2结合,引起髓系细胞释放IL-6、IL-1β等炎症因子,导致患者出现细胞因子释放综合征。

LILRB2过表达慢病毒载体以及THP-1-LILRB2稳转细胞株的构建

目的采用慢病毒载体(lentivirus,LV)感染并探究其在人髓系白血病单核细胞(human myeloid leukemia mononuclear cells,THP-1)中的最佳感染条件,之后病毒包装白细胞免疫球蛋白样受体B2(leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 2,LILRB2)的过表达病毒载体并感染THP-1细胞,最终嘌呤霉素筛选出经mRNA和蛋白水平均成功验证LILRB2过表达效果的THP-1稳定转染细胞株,为研究LILRB2在单核细胞中的作用提供前提条件。方法LILRB2过表达慢病毒载体以pLV-SFFV-MCS-EF1-ZsGreen1-T2A-Puro为慢病毒骨架载体,通过Xba I与BamH I位点插入经聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增的LILRB2基因片段构建而成。待筛选阳性克隆与测序鉴定后,病毒感染预实验确定感染复数(multiplicity of infection,MOI);以293T细胞包装病毒,浓缩后获得的原液进行病毒滴度检测。设置过表达(LV-OE-LILRB2)组和对照(LV-OE-NC)组,用荧光显微镜观察各组病毒感染THP-1的绿色荧光情况;嘌呤霉素筛选出稳定表达LILRB2的THP-1细胞株。采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和免疫印迹(Western blotting,WB)的方法分别检测THP-1细胞中LILRB2的mRNA和蛋白表达水平。结果载体中的碱基序列经PCR及测序鉴定正确,确认LILRB2过表达慢病毒载体构建完成。病毒感染预实验确定按MOI=5,感染72 h的条件感染单核细胞系THP-1。病毒滴度测定得出,LV-OE-LILRB2组的滴度为1×108 TU/mL,LV-OE-NC组的滴度为3.3×108 TU/mL。用浓度为2μg/mL嘌呤霉素筛选出的稳转细胞株经qPCR检测结果表明LV-OE-LILRB2组中LILRB2的mRNA表达水平较LV-OE-NC组显著上调(P<0.001);且WB检测表明LV-OE-LILRB2组中LILRB2的蛋白表达水平较LV-OE-NC组明显提高(P<0.05)。结论过表达LILRB2慢病毒载体成功构建并在THP-1细胞株中稳定表达,为研究LILRB2在单核细胞中的作用机制提供了细胞模型。

抑制LILRB2对人结直肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响

目的探索LILRB2对结直肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响,并进一步探索其机制。方法体外培养结直肠癌SW480细胞,并将其分为空白对照组、阴性对照组及实验组。利用流式细胞仪检测LILRB2的表达情况。利用qPCR检测LILRB2的表达,将空载体质粒和LILRB2质粒分别转染入SW480细胞;利用CCK-8法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot实验对蛋白表达变化进行检测。结果LILRB2在SW480中的表达量为0.84±0.09,较FHC细胞提升两倍0.38±0.05,差异具有统计学意义(P<0.05)。病毒感染后实验组SW480细胞中LILRB2的表达量(0.48±0.07)明显降低。CCK-8实验结果所示,处理12 h后LILRB2低表达实验组的SW480细胞增殖情况被抑制,LILRB2低表达的实验组的SW480细胞细胞凋亡比例上升为49.3%±1.2%,与空白对照组和阴性对照组的细胞凋亡比例(7.48%±0.85%)、(7.35%±0.93%)相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。LILRB2低表达的实验组SW480细胞的活性氧水平(3.34±0.29)远高于与空白对照组(1.03±0.12)和阴性对照组(1.07±0.09),差异有统计学意义(P<0.05);在加入ROS清除剂NAC之后,LILRB2低表达实验组细胞凋亡上升。结论LILRB2低表达抑制SW480细胞的增殖,诱导细胞凋亡,其可能通过调控ROS水平发挥作用,为LILRB2在结直肠癌的研究中提供一定的理论基础。

HIV-1感染者单核细胞亚群中人免疫球蛋白样受体亚家族B成员2与免疫重建不良免疫表型的相关性研究

目的探究不同HIV-1感染者单核细胞亚群中人免疫球蛋白样受体亚家族B成员2(leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 2,LILRB2)与免疫表面相关分子的共表达,分析LILRB2与HIV-1感染免疫重建不良者的相关性。方法选取2021年1月—2022年9月,在北京佑安医院感染中心就诊的男男性行为人群(men who have sex with men,MSM)慢性HIV-1感染者为研究对象,将其分为健康对照组(healthy controls,HCs组,n=22)、慢性HIV-1感染且未接受抗病毒治疗组(treatment-naïve patients,TNs组,n=22)、免疫重建良好组(immune responders,IRs组,n=22)和免疫重建不良组(immune non-responders,INRs组,n=22)。流式细胞术检测各组经典型(CD14^(++)CD16-)、中间型(CD14^(++)CD16^(+))、非经典型(CD14^(+)CD16^(++))单核细胞亚群中LILRB2的表达比例,及其与免疫分子CD80、CD86、CD163、人类白细胞DR抗原(HLA-DR)和PD-L1的共表达情况,组间比较采用Kruskal-Wallis检验,然后采用Dunn多重比较进行统计分析。结果INRs组CD14^(+)CD16^(++)单核细胞亚群LILRB2的表达水平显著高于IRs组(P<0.05)、TNs组(P<0.05)和HCs组(P<0.001)。TNs组CD14^(+)CD16^(++)单核细胞LILRB2和CD80的共表达水平显著高于HCs组(P<0.001)、IRs组(P<0.01)和INRs组(P<0.001)。INRs组CD14^(+)CD16^(++)单核细胞亚群LILRB2和CD86的共表达水平显著高于HCs组(P=0.001)、TNs组(P<0.05)和IRs组(P<0.05)。各组CD14^(++)CD16^(+)单核细胞LILRB2和CD163的共表达差异最为显著,其中INRs组显著低于IRs组(P<0.01)和HCs组(P<0.01)。在CD14^(+)CD16^(++)单核细胞中,INRs组和TNs组的HLA-DR和LILRB2共表达情况相近,均显著高于HCs组(P<0.01,P<0.05)。结论LILRB2与HIV-1感染者的单核细胞异常活化有关,其在单核亚群中的表达变化与免疫重建不良的发生存在潜在关联。