胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1在人牙髓细胞体外矿化过程中表达的实验研究

目的:研究胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1在人牙髓细胞体外矿化过程中的表达。方法:利用组织块法体外培养人牙髓细胞,实验组培养液中加入矿化诱导剂,对照组不加矿化诱导剂。培养14d后,免疫细胞化学检测牙本质涎蛋白的表达;von kossa染色检测矿化结节的形成。培养期间,采用半定量RT-PCR技术监测LIM矿化蛋白1及碱性磷酸酶的表达,SPSS11.0软件分析结果。结果:培养14d,实验组牙本质涎蛋白免疫细胞化学呈阳性表达,von kossa染色阳性,矿化结节形成;对照组牙本质涎蛋白表达阴性,von kossa染色阴性。RT-PCR结果显示碱性磷酸酶及LIM矿化蛋白1在实验组和对照组各时段均表达。培养期间,实验组LIM矿化蛋白1的表达显著性高于对照组,其中培养第2天及9天时表达分别达到两个高峰,约为对照组的1.8倍及3.0倍。培养期间,碱性磷酸酶的表达显著性增高,其中培养14d时约为对照组的2.0倍。结论:首次发现LIM矿化蛋白1与人牙髓细胞的体外矿化过程相关,提示LIM矿化蛋白1可能在牙髓细胞的分化及矿化中发挥一定作用。

胞内信号转导分子LIM矿化蛋白-1在人牙周膜细胞体外矿化过程中表达的实验研究

目的:研究胞内信号转导分子LIM矿化蛋白-1在人牙周膜细胞体外矿化过程中的表达。方法:利用组织块法体外培养人牙周膜细胞,实验组培养液中加入矿化诱导剂,对照组不加矿化诱导剂。培养14 d后,免疫细胞化学检测骨涎蛋白的表达;von Kossa染色检测矿化结节的形成。培养期间,采用半定量RT-PCR技术监测LIM矿化蛋白-1、碱性磷酸酶的表达,SPSS11.0软件分析结果。结果:培养14 d,实验组骨涎蛋白免疫细胞化学呈阳性表达,von Kossa染色阳性,矿化结节形成;对照组骨涎蛋白表达阴性,von Kossa染色阴性。RT-PCR结果显示碱性磷酸酶、LIM矿化蛋白-1在实验组和对照组各时段均表达。培养期间,实验组LIM矿化蛋白-1的表达显著高于对照组,其中培养第3 d、14 d时表达分别达到两个高峰,约为对照组的1.4倍、1.5倍。培养期间,碱性磷酸酶的表达显著增高,其中培养14 d时约为对照组的1.5倍。结论:首次发现LIM矿化蛋白-1与人牙周膜细胞的体外矿化过程相关,提示LIM矿化蛋白-1可能在牙周膜细胞的分化、矿化中发挥一定作用。

人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达

背景:研究表明LIM矿化蛋白1在体内和体外都可促使骨发生。目的:应用Adeasy-1腺病毒系统构建含人LIM矿化蛋白1基因的腺病毒重组体,并感染犬骨髓间充质干细胞,检测其体外表达及诱导成骨作用。方法:构建重组腺病毒质粒pAd-LMP-1,经人胚胎肾293细胞包装、扩增后得到复制缺陷重组腺病毒Ad-LMP-1,以最佳感染复数值体外感染犬骨髓间充质干细胞,行RT-PCR及Western Blot检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白7基因的表达。重组Ad-LMP-1和(或)外源性重组人骨形态发生蛋白7处理犬骨髓间充质干细胞,21d后行矿化(钙)结节茜素红染色分析LIM矿化蛋白1基因的诱导成骨作用。结果与结论:①将Ad-LMP-1以感染复数值100感染犬骨髓间充质干细胞可获得最佳感染效率,感染后骨髓间充质干细胞能在基因和蛋白水平表达LIM矿化蛋白1,未引起骨形态发生蛋白7基因的表达。②Ad-LMP-1或重组人骨形态发生蛋白7均不能单独促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,两者联合可促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化。③实验成功构建重组腺病毒载体Ad-LMP-1,并实现其在犬骨髓间充质干细胞中表达,证实了LIM矿化蛋白1在诱导成骨作用中表现为与外源性重组人骨形态发生蛋白7的协同效应。

LIM矿化蛋白1/低氧诱导因子1α慢病毒载体转染脂肪源性干细胞的成骨分化

背景:LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α作为胞内蛋白,可分别从诱导成骨分化及促进血管再生两个方面促进成骨,联合二者高效诱导脂肪源性干细胞成骨分化具有重要的意义。目的:探讨慢病毒载体介导的LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α双基因转染的脂肪源性干细胞成骨分化的情况。方法:应用反转录PCR技术克隆目的基因LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α片段,并分别克隆于慢病毒骨架质粒p LVX-EF1α-DsR ed-Hyg和p LVX-EF1α-IRES2-AcG FP1中,构建慢病毒载体主体质粒p LVX-EF1α-DsR ed-Hyg-RLMP-1和p LVX-EF1α-AcG FP-RHIF-1α,随即与辅助质粒和包装质粒共转染Lenti-X 293T细胞,包装慢病毒载体;采用组织块加酶消化法分离培养大鼠脂肪源性干细胞,使用流式细胞仪对其进行鉴定。分别在慢病毒转染脂肪源性干细胞3,7,14 d后,应用反转录PCR方法检测脂肪源性干细胞中成骨基因骨形态发生蛋白2、Runx-2、碱性磷酸酶、骨钙蛋白表达水平的同时检测血管内皮生长因子的表达水平。结果与结论:pL VX-EF1α-DsR ed-Hyg-RLMP-1和p LVX-EF1α-Ac GFP-RHIF-1α可有效地转染入大鼠脂肪源性干细胞;反转录PCR结果显示成骨基因骨形态发生蛋白2、Runx-2、碱性磷酸酶、骨钙蛋白在LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α双基因转染后第7天都开始明显过表达,并且可持续到14 d。说明LIM矿化蛋白1及低氧诱导因子1α双基因转染脂肪源性干细胞可提高其成骨活性。

LIM矿化蛋白-1对间充质干细胞成骨分化影响的实验研究

目的:构建LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)的真核表达质粒,并在兔骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs)内表达,研究LMP-1对体外培养BMSCs成骨分化的影响。方法:RT-PCR克隆hLMP-1和骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2),并构建pIRES2-EGFP-LMP-1及pIRES2-EGFP-BMP-2重组质粒。分离培养BMSCs,脂质体介导下将pIRES2-EGFP-LMP-1、pIRES2-EGFP-BMP-2和pIRES2-EGFP质粒转染BMSCs。7 d后收集细胞,RT-PCR比较hLMP-1、hBMP-2及Ⅰ型胶原的表达,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,免疫组化染色比较骨钙素表达。结果:pIRES2-EGFP-LMP-1和pIRES2-EGFP-BMP-2重组质粒构建成功。重组质粒成功转染BMSCs,RT-PCR证实表达目的基因,hLMP-1和hBMP-2转染组可以明显促进细胞分泌ALP的活性,诱导Ⅰ型胶原和骨钙素的表达。结论:LMP-1可以促进BMSCs向成骨细胞分化。

LIM矿化蛋白1在大鼠牙髓损伤修复中的时空表达

目的 :探讨LIM矿化蛋白1(LIM mineralization protein 1,LMP-1)在大鼠磨牙牙髓损伤修复中的表达。方法 :建立大鼠磨牙牙髓损伤修复动物模型,用免疫组织化学染色方法观察LMP-1在大鼠牙髓损伤修复中的表达,并用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件及单因素方差分析比较各组间的差异。结果 :在正常大鼠牙髓组织中LMP-1表达阴性;在大鼠牙髓损伤后1 d,LMP-1表达于成牙本质细胞及部分牙髓成纤维细胞;术后3 d,LMP-1表达于坏死牙髓下方的细胞增殖层;术后7 d,LMP-1显著表达于增殖活跃的牙髓细胞及部分成牙本质细胞中。结论:LMP-1在牙髓损伤修复过程中呈时空特异性表达,可能参与成牙本质细胞及牙髓细胞的增殖、分化及修复性牙本质的形成。

LIM矿化蛋白1促进成骨的研究现状

目的 LIM矿化蛋白1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)是一种细胞内非分泌蛋白,通过调节BMPs信号通路而促进成骨分化。近年来,研究表明LMP-1作为成骨信号途径的上游信号分子级联放大下游成骨信号,增加成骨细胞对BMPs的敏感性,招募众多的成骨因子共同参与成骨,最终促进细胞成骨分化和诱导骨形成。本文就LMP-1的结构特点、诱导成骨机制、LMP-1用于基因治疗的种子细胞及载体的选择等研究现状作一综述。

雌激素对小鼠骨髓间质细胞LIM矿化蛋白-1 mRNA表达的影响

目的探讨雌激素对小鼠骨髓间质细胞LIM矿化蛋白-1(LIMmineralization protein-1,LMP-1)基因转录的影响。方法卵巢切除5个月后小鼠的骨髓间质干细胞经7 d成骨诱导后,用100 nmol/L 17β-雌二醇(17β-E2)处理24 h,通过RT-PCR法扩增LMP-1的mRNA,测定扩增条带的吸光度值,并用其与β-actin吸光度的比值来表示产物mRNA的相对含量。结果17β-E2处理组LMP-1的mRNA表达明显高于非处理组(P<0.01)。结论雌激素可通过促进骨髓间质细胞LMP-1的mRNA表达以发挥其促成骨作用。

六白菖砂粒剂对颈椎病动物模型骨形态发生蛋白2及LIM矿化蛋白1的影响

背景:骨形态发生蛋白2与LIM矿化蛋白1在成骨细胞分化、成熟中有重要作用,与颈椎病的发生有很大联系。目的:观察六白菖砂粒剂对家兔颈椎病模型外周血清中骨形态发生蛋白2、LIM矿化蛋白1的影响。方法:将50只成年健康雄性大耳白兔随机分为5组。除正常对照组外采用蹲坐低头位制作颈椎病动物模型。颈复康对照组每天以颈复康0.25g灌胃,六白菖砂粒剂高剂量组和低剂量组每天分别以0.5g、0.25g灌胃,正常对照组和模型对照组予同等容量的蒸馏水灌胃。与4周、12周测量动物颈椎骨密度,12周时取椎体检测离体骨密度,并检测外周血清中骨形态发生蛋白2、LIM矿化蛋白1因子水平。结果与结论:六白菖砂粒剂高剂量组中骨形态发生蛋白2、LIM矿化蛋白1水平显著高于空白对照组、颈椎病模型对照组和六白菖砂粒剂低剂量组(P<0.05);颈椎病模型对照组中骨形态发生蛋白2、LIM矿化蛋白1水平明显低于正常对照组、颈复康颗粒对照组和六白菖砂粒剂高剂量组(P<0.05),而与六白菖砂粒剂低剂量组相比差异无显著性意义(P>0.05)。提示六白菖砂粒剂是通过提高家兔血清骨形态发生蛋白2、LIM矿化蛋白1水平对颈椎病产生疗效。

LIM矿化蛋白1过表达对骨肉瘤细胞系OS-9901细胞增殖的影响

目的探讨骨肉瘤细胞系OS-9901细胞中LIM矿化蛋白1(LMP-1)过表达对该细胞增殖的影响。方法构建LMP-1过表达慢病毒载体,通过脂质体转染进骨肉瘤细胞系OS-9901细胞。通过荧光定量PCR和Western blot检测LMP-1过表达情况,并通过BrdU掺入实验比较LMP-1过表达前后细胞增殖情况。结果转染了LMP-1过表达慢病毒载体6 h后细胞内LMP-1 mRNA和蛋白表达均无显著变化(P>0.05),且DNA合成量无显著变化。而当LMP-1过表达慢病毒载体转染细胞12、24和48 h后细胞内LMP-1 mRNA和蛋白表达量均显著提高的同时,DNA合成量显著降低(P<0.05)。结论 LMP-1过表达可抑制骨肉瘤细胞系OS-9901细胞增殖。

LIM矿化蛋白研究进展

LIM矿化蛋白(LIM mineralization protein,LMP)包括:LMP-1、LMP-2和LMP-3三种基因型。LIM-1和LMP-3有直接或间接的促进成骨作用。LMP-1在人周膜细胞、牙髓细胞、成牙本质细胞表达。该文就LMP-1矿化蛋白的结构、作用以及在牙齿修复、再生方面的应用作一综述。

LIM矿化蛋白-1发挥成骨效应的机制探讨

近来大量研究证实,LIM矿化蛋白-1(LMP-1)是一种细胞内骨架蛋白,属于PDZ-LIM蛋白家族,参与细胞成骨分化的早期阶段;其不同结构域各有其独特的作用,它们可通过招募多种成骨因子、促进细胞增殖、上调成骨相关基因表达、减少炎性骨丢失等多种途径发挥其促成骨效应。LMP-1可通过其不同结构域的协同作用发挥强大的促成骨效应。本文对LMP-1发挥成骨效应的机制探讨作一综述。

雌激素活化LIM矿化蛋白-1的mRNA表达与雌激素受体的关系

目的探讨雌激素受体信号转导与LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)基因转录的关系。方法将卵巢切除5个月后小鼠的骨髓间充质干细胞经7d成骨诱导后,用10μmol/L的ICI-182,780(ICI)和/或100nmol/L17β-雌二醇(17β-E2)处理24h,通过RT-PCR法扩增LMP-1的mRNA,测定扩增条带的吸光度值,并与β-actin的吸光度值相比,比值来表示产物mRNA的相对含量。结果ICI处理组LMP-1的mRNA表达明显低于17β-E2处理组(P<0.01)。结论雌激素刺激间充质干细胞LMP-1的mRNA表达是雌激素受体依赖性的。

LIM矿化蛋白1对牙周膜细胞生物学特性的影响

目的以LIM矿化蛋白1(LIM mineralization protein 1,LMP-1)基因构建真核表达载体PET43.1a-LMP-1,转染人牙周膜细胞,观察对其生物学特性的影响。方法采用基因工程技术构建真核表达载体pET43.1a-LMP-1,脂质体法转染人牙周膜细胞,四唑盐比色法和酶联免疫吸附测定法测定真核表达载体pET43.1a-LMP-1转染对牙周膜细胞活性以及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的影响。结果与空质粒转染组和空白对照组相比,pET43.1a-LMP-1真核表达载体转染后牙周膜细胞中LMP-1 mRNA和蛋白表达显著增强(P<0.05);细胞增殖明显增加;ALP表达明显增强,并随时间延长逐渐上升。结论外源性LMP-1转染进入牙周膜细胞能够促进细胞的增殖和矿化能力。

LIM矿化蛋白1在牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞中的研究进展

LIM矿化蛋白1(LMP-1)是一种胞内信号转导分子,体内外研究表明它在成骨细胞分化过程中起到促进骨形成的重要作用。目前认为LMP-1是通过刺激某些诱导骨形成的因子如骨形态发生蛋白(BMP)的合成及分泌发挥作用,从而提高骨形态发生蛋白及其他成骨因子的成骨活性。该文围绕LMP-1的作用及在牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞矿化方面的研究现状作一综述。

LMP-1基因转染骨髓间充质干细胞的LIM矿化蛋白表达

背景:体外实验提示LMP-1基因可提高骨质疏松性骨髓间充质干细胞LMP-1蛋白的表达。目的:用含有LIM矿化蛋白1基因的反转录病毒载体(RV-LMP-1-GFP)转染骨质疏松性SD大鼠骨髓间充质干细胞,检测其对骨质疏松性骨髓间充质干细胞LIM矿化蛋白表达的影响。方法:随机取雌性SD大鼠12只,采用双侧卵巢切除法建立骨质疏松性大鼠模型,另取6只大鼠仅切除卵巢周围等量脂肪组织,保留卵巢为假手术组。喂养2个月后取双侧股骨、胫骨、肱骨分离培养其骨髓间充质干细胞。均取3代培养细胞随机分为去势组、LMP-1转染组(转染LMP-1基因)和假手术组。分别行RT-PCR及Western-Blot检测各组细胞LIM矿化蛋白1 mRNA和蛋白的表达。结果与结论:培养出骨质疏松性SD大鼠骨髓间充质干细胞,转染后倒置荧光显微镜下可见绿色荧光表达;3组细胞均可在基因及蛋白水平表达LIM矿化蛋白1。与假手术组及去势组比较,LMP-1基因转染组的LIM-1mRNA和蛋白的表达均升高显著(P<0.05),假手术组与去势组之间差异无显著性意义(P>0.05)。成功实现重组RV-LMP-1-GFP基因在骨质疏松性SD大鼠骨髓间充质干细胞中mRNA和蛋白水平的表达,且LMP-1的表达水平显著提高。结果表明重组LMP-1基因成功导入骨质疏松性大鼠骨髓间充质干细胞基因组中,并使得LMP-1 mRNA和蛋白的表达明显提高。

研究两种干细胞体外矿化过程中LIM矿化蛋白1的表达

目的 LIM矿化蛋白1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)是一种胞内非分泌型蛋白,广泛存在于各种组织中,它不仅影响骨基质的矿化而且还是成骨细胞分化和骨形成过程中重要的调节因子。本实验通过检测LMP-1在牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞体外矿化过程中的表达情况,来研究胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1对牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞体外矿化的作用,为LMP-1作为成骨调节因子,影响骨基质矿化方面的研究提供参考。方法酶消化法体外培养牙髓干细胞,用挑克隆细胞团的方法对牙髓干细胞进行纯化传代培养。密度梯度离心法体外培养骨髓间充质干细胞。两种细胞分别设置实验组和对照组。实验组培养液中加入矿化诱导液,对照组不加矿化诱导液。分别于培养3、5、7、14天检测碱性磷酸酶的活性。培养21天茜素红染色检测矿化结节形成。培养期间,采用荧光定量PCR方法检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白BMP-2、牙本质涎磷蛋白DSPP和Ⅰ型胶原蛋白COL-1、核心结合因子RUNX-2等成骨标志基因的表达,用SPSS 17.0对结果进行统计学分析。结果培养3、5、7、14天碱性磷酸酶的活性逐渐提高,且实验组碱性磷酸酶的活性显著高于对照组。培养21天实验组可见矿化结节形成。荧光定量PCR检测到实验组及对照组各个基因均表达,且实验组表达显著高于对照组。结论发现LIM矿化蛋白1与牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞体外矿化过程相关,推测LIM矿化蛋白1可能作为检测牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞矿化的一个指标。

LIM矿化蛋白-1与LIM矿化蛋白-3共转染骨髓间充质干细胞的基因表达

目的探讨LIM矿化蛋白(LIM mineralization protein,LMP)-1和LMP-3双基因共转染骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)的表达情况。方法采用人工设计合成人LMP-1和LMP-3基因片段,分别与质粒pEGFP-N2连接,经酶切、测序鉴定后。分离培养新西兰兔BMSC,用脂质体包裹转染BMSC,按转染情况分为5组:未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染LMP-1基因组(C组)、转染LMP-3基因组(D组)、LMP-1与LMP-3双基因共转染组(E组)。采用实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白质印迹法检测LMP-1和LMP-3的表达。结果酶切及测序表明真核表达质粒pEGFP-N2-LMP-1和pEGFP-N2-LMP-3构建成功。E组可同时较高水平表达LMP-1和LMP-3分子。对RT-PCR及蛋白质印迹法检测结果行灰度值测量并行统计学分析显示:LMP-1 mRNA及蛋白水平的表达,5组间差异有统计学意义(P<0.05),但E组与C组的差异无统计学意义(P>0.05);LMP-3 mRNA及蛋白水平的表达,5组间差异有统计学意义(P<0.05),且E组与D组差异也有统计学意义(P<0.05)。结论双基因共转染的BMSC能在体外同时表达LMP-1与LMP-3,为基因修复骨缺损带来新思路。

LIM矿化蛋白-1与颈椎后纵韧带骨化相关性的实验研究

[目的]研究LIM矿化蛋白-1（LMP-1）与颈椎后纵韧带骨化（OPLL）形成的相关性,为OPLL的预防提供新的理论方法。[方法]选取2012年3月~2013年12月本院颈椎后纵韧带骨化患者手术切除的16例后纵韧带标本为OPLL组,非骨化的20例颈椎后纵韧带标本为非OPLL组,通过免疫组织化学染色及RT-PCR技术分别检测两组标本中LMP-1及其mRNA的表达情况。[结果]LMP-1在OPLL组及非OPLL组中均有表达;LMP-1在OPLL组中表达量高于非OPLL组,二者差异有统计学意义（P〈0.05）。[结论]LMP-1与OPLL的形成有一定的相关性,是OPLL形成的原因之一;通过调节LMP-1的表达可能对OPLL的防治提供一个新的理论基础。