青岛文昌鱼LIM类基因Bblim同源框区的cDNA克隆、序列分析及其在胚胎发育中的表达

不同卵裂球发育命运的特化、亦即胚胎细胞的分化是动物胚胎发育的重要特征。多数胚胎细胞尽管形态特征完全一致，却具有不同的发育命运。预示着：在这些细胞中存在有决定发育命运的因素－决定子。本工作克隆了青岛文昌鱼LIM类同源框基因的同源框片段。目的在于揭示决定子的分子本质。青岛近海采集性成熟的成年青岛文昌鱼，收集未受精卵、受精卵以及各处不同时期的胚胎，液氮冻存备用。分别制备总RNA。根据其它动物LIM类同源框基因的序列设计引物（Tab.1)，连续进行RT－PCR和PCR两次扩增。其中，原肠胚来源的第二次PCR产物经电泳鉴定（Fig.1)后，酶切、克隆入质粒、测序、将该片段所在的基因命名为Bblim基因，该自然称为Bblim同源框。根据Bblim基因同源框的核苷酸序列推导出其相应的氨基酸序列（Fig.2)，与其它LIM类同源框基因进行比较（Fig.3)后，认为：Bblim基因可归入lim3类基因。比较胚胎发育各个不同时期第二次PCR产物的含量－即Bblim基因的转录（Fig.4)，提示：该基因可能在受精后和原肠成形前后两个发育阶段起作用。此外，Bblim基因的同源域与海鞘Hrlim的同源域高度同源，表达模式也相似，提示，Bblim基因可能是Hrlim基因在文昌鱼中的类似物。

青岛文昌鱼LIM类基因Bblim同源框区的内含子分析

LIM类同源框基因（homeobox gene）保守性很强，在动物界广泛存在。各种LIM类同源框基因的共同点是：在结构上，LIM类同源框基因的编码蛋白都具有同源域和LIM结构域；在生物学功能方面，都与早期发育中胚胎谱系的决定和胚胎细胞分化有关。本实验提取青岛文昌鱼基因组DNA，用一对简并引物对其LIM类同源框基因Bblim进行PCR扩增，将得DNA片段克隆到pBluescriptⅡKS（＋）质粒上，经测序发现，其同源框区比大多数LIM类基因的同源框区要长得多，其上插入有一个长度为138bp的内含子（Fig.1)。这个内含子的序中有真核生物核基因mRNA内含子的内型序列。并且与该基因cDNA克隆的测序结果相吻合。从而，可以确诊该序列中这个内含子的存在。已知绝大多数LIM类同源框基因的同源框区无内含子。因此，有必要对其作深入研究。

逆转录-PCR扩增文昌鱼LIM类同源框基因片段

于1997年6月在青岛市沙子口海域采集文昌鱼样品，采用RT-PCR方法进行青岛文昌鱼LIM类同源框基因片段的扩增研究。结果表明，用一对引物一次PCR扩增的方法未能得到特异的PCR产物，用一对引物两次PCR扩增的方法也同样未果。在对套式PCR进行研究时发现，用普遍PCR方法进行的套式PCR结果不够理想，而用三步两段法和四步两段法套式PCR则可进行成功的扩增。用这两种方法扩增的PCR产物具有高度特异性。相比之下，用简并的引物对未知的基因片段进行PCR扩增时，三步两段法和四步两段法的套式PCR应是首选方法。