重组腺病毒载体Ad-LMP-1的构建及其转染MSC后成骨活性

【目的】快速构建大鼠LIM矿化蛋白-1基因重组腺病毒载体,转染MSC,探讨LMP-1基因对MSC成骨分化和成骨活性的影响。【方法】从大鼠成骨细胞内提取总RNA,并设计LMP-1特异性引物进行RT-PCR,获取LMP-1基因后利用Invitrogen公司的TOPO定向克隆技术创建入门克隆pENTR/D-LMP-1。转化TOP10细菌后,挑取阳性克隆摇菌提取质粒,入门克隆再与表达载体pAD/CMV/V5-DEST进行同源重组反应得到病毒载体pAD/CMV/V5-LMP-1,转化细菌后挑选阳性克隆摇菌提取重组病毒质粒,用PacI内切酶线性化后用转染293A细胞后得到重组腺病毒载体。以腺病毒为载体,将大鼠LMP-1基因体外转染于3代大鼠MSC细胞内,检测LMP-1基因在MSC细胞的表达,分别观察转染后实验组与对照组I型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素表达变化以及骨钙结节的形成情况,评价LMP-1基因的成骨能力。【结果】成功获取大鼠LMP-1基因,入门质粒与病毒表达质粒经过酶切鉴定以及测序验证。LMP-1基因能在MSC中高效表达,转然后MSC的I型胶原,碱性磷酸酶、骨钙素的表达明显增强,骨钙结节形成增多。【结论】利用Gateway技术构建LMP-1重组腺病毒载体相对简单,可快捷获得的pAd-LMP-1。pAd-LMP-1转染MSC后,LMP-1基因能促进MSC向成骨细胞分化,增强其成骨作用。

人LIM矿化蛋白-1重组腺病毒的成骨作用及其分子机制

目的 利用pAdEasy腺病毒载体系统构建人LIM矿化蛋白-1（LMP-1）重组腺病毒,检测其在体外培养大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）的促成骨作用并分析其分子机制.方法 应用聚合酶链反应（PCR）法扩增出人LMP-1全长基因,插入pShuttle-IRES-hrGFP-1中构建成腺病毒穿梭质粒pS-LMP-1-GFP,转化DH5a大肠杆菌,挑选细菌单克隆进行酶切鉴定和DNA测序;通过pS-LMP-1-GFP与质粒pAdEasy-1在BJ5183细胞中同源重组,得到携带人LMP-1基因的重组腺病毒载体（pAdLMP-1-GFP）.经PacⅠ酶切暴露两侧长末端重复序列,脂质体介导线性化质粒转染AD293细胞进行包装得到重组腺病毒Ad-LMP-1-GFP.以腺病毒为载体,将 人LMP-1 基因体外转染于第3代大鼠BMSCs内,检测LMP-1基因在BMSCs的表达,分别观察转染后实验组与对照组碱性磷酸酶活性变化,Western blot检测骨钙素（OCN）和β-连环蛋白（β-catenin）的表达,评价LMP-1 基因的成骨能力及其分子机制.结果 成功获取人LMP-1基因,并包装成重组腺病毒.LMP-1基因能在BMSCs 中高效表达,转染后BMSCs的碱性磷酸酶活性增强,与对照组比较P=0.000,分别为0.096、0.116、0.118、0.119（0.110±0.011）和 0.045、0.057、0.056、0.054（0.053±0.005）;骨钙素的表达显著升高,与对照组比较P=0.001,分别为0.661、0.767、0.651（0.693±0.064）和0.177、0.290、0.222（0.229±0.050）;β-catenin的表达明显增强,与对照组比较P=0.002,分别为0.841、0.806、0.867（0.838±0.030）和0.185、0.236、0.266（0.229±0.040）.结论 成功利用pAdEasy系统构建人LMP-1重组腺病毒载体,包装获得重组腺病毒.Ad-LMP-1-GFP转染BMSCs后,LMP-1基因能促进BMSCs向成骨细胞分化,并且可能通过β-catenin信号分子发挥作用.

人低氧诱导因子-1α和LIM矿化蛋白-1联合表达重组腺病毒构建及其成骨作用

目的利用内部核糖体进入位点（IRES）连接低氧诱导因子-1α（HIF-1α）与LIM矿化蛋白-1（LMP-1），构建同时表达LMP-1和HIF-1α的腺病毒载体，检测其在体外培养大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）的成骨作用。方法应用聚合酶链反应（PCR）法扩增出人HIF-1α（2 481 bp）和LMP-1（1 374 bp）及IRES（564 bp）序列，依次插入pShuttle-IRES-hrGFP-1中构建腺病毒穿梭质粒pS-HIF-LMP-1-GFP；将其与质粒pAdEasy-1在BJ5183细胞中同源重组，得到重组腺病毒质粒（pAd-HIF-LMP-1-GFP）。经Pac I酶切转染AD293细胞进行包装得到重组腺病毒Ad-HIF-LMP-1-GFP。以腺病毒为载体，将人HIF-1α和LMP-1联合基因转染大鼠BMSCs细胞，分别观察转染后实验组与对照组碱性磷酸酶活性、钙形成以及骨钙素和核心结合蛋白因子2（Runx2）的表达变化，探讨HIF-1α与LMP-1联合表达的成骨作用。结果成功获取联合表达HIF-1α与LMP-1的重组腺病毒。HIF-1α和LMP-1基因能在BMSCs中高效表达，转染后BMSCs的碱性磷酸酶活性增强，与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.000），活性分别为0.145、0.160、0.170、0.167（0.160±0.011） ng/μg蛋白和0.045、0.057、0.056、0.054（0.053±0.005） ng/μg蛋白；钙沉积明显增多，与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.001），钙形成定量分别为0.636、0.544、0.591、0.515（0.570±0.050）和0.121、0.150、0.144、0.167（0.145±0.019）；骨钙素表达显著提高，与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.017），分别为2.688、2.997、2.777（2.820±0.159）和2.009、1.916、1.944（1.956±0.047）；Runx2的表达明显增强，与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.000），分别为0.440、0.465、0.456（0.454±0.010）和0.096、0.108、0.117（0.107±0.010）。结论成功利用IRES序列连接人HIF-1α和LMP-1基因构建重组腺病毒载体，Ad-HIF-LMP-1-GFP转染BMSCs后，能明显促进BMSCs向成骨细胞分化。