Livin基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗对急性心肌梗死大鼠心功能的影响

目的:探讨livin修饰的骨髓间充质干细胞(MSCs)移植改善急性心肌梗死大鼠心功能的作用及livin和促凋亡蛋白caspase-3、caspase-7、caspase-9在感染后的表达情况。方法:通过全骨髓培养法分离培养骨髓间充质干细胞,感染携带livin基因的重组腺病毒后用流式检测其对MSCs凋亡的影响。通过Western blot法分别检测livin、caspase-3、caspase-7和caspase-9的蛋白表达情况。采用冠状动脉左前降支结扎法建立心肌梗死模型,然后实验分4组进行:无胎牛血清的DMEM组;单纯干细胞治疗组(MSCs组);空载腺病毒转染干细胞组(r Ad-control/MSCs)组;livin基因转染干细胞组(r Ad-livin/MSCs组)。1个月后采用生理仪记录各组大鼠左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室内压最大上升速率(+dp/dt_(max))和左室内压最大下降速率(-dp/dt_(max))来评价大鼠心功能。结果:r Ad-livin/MSCs组凋亡率较MSCs组和r Ad-control/MSCs组显著降低(P<0.05);r Ad-livin/MSCs组抗凋亡蛋白livin明显上升(P<0.05),促凋亡蛋白caspase-3、caspase-7及caspase-9表达显著下降(P<0.05);细胞移植后1个月,r Ad-livin/MSCs组心功能比MSCs组改善更明显(P<0.05)。结论:r Ad-livin感染MSCs后可促进抗凋亡蛋白livin的表达,同时降低促凋亡蛋白caspase-3、caspase-7和caspase-9的表达及细胞凋亡率。r Ad-livin/MSCs移植能进一步改善心肌梗死大鼠心功能。

慢病毒介导shRNA特异性沉默livin基因促进SPC-A1细胞凋亡

目的:建立慢病毒介导的livin基因沉默系统,探讨其对肺癌细胞凋亡的影响。方法:Livin shRNA慢病毒感染肺腺癌细胞株SPC-A1沉默livin基因表达。应用PI染色经荧光镜下观察SPC-A1细胞凋亡形态,流式细胞术检测SPC-A1细胞凋亡率及亚二倍体峰形成,Real-timePCR及Western blotting方法检测livin和caspase3表达的改变。结果:livin基因在肺腺癌细胞株SPC-A1中持续高表达。经慢病毒介导shRNA使livin基因表达沉默后,镜下可见肺腺癌细胞出现典型凋亡形态特征,流式细胞术检测出现亚二倍体峰,细胞凋亡率较空白对照及阴性病毒对照细胞明显增加(8.21%vs0.08%,0.13%;P<0.05),RT-PCR及Western blotting检测结果显示,caspase3mRNA表达无改变,但cleaved-caspase3蛋白表达上调。结论:慢病毒载体介导的shRNA能抑制肺腺癌细胞株SPC-A1中livin基因的表达,从而促进SPC-A1细胞凋亡。

siRNA沉默人乳腺癌细胞株Livin基因的实验研究

目的探讨Livin-siRNA对人乳腺癌细胞株MCF-7和ZR-75-30中Livin基因及蛋白表达的下调作用,以及对其增殖能力的影响。方法构建3个靶向Livin的siRNA真核表达载体,分别转染乳腺癌细胞后,通过实时定量PCR、Western blot技术检测人乳腺癌细胞MCF-7,ZR-75-30的Livin在mRNA、蛋白水平的表达。采用MTT法检测si-Livin2对乳腺癌细胞增殖的抑制作用。结果成功构建了针对Livin基因的3个特异性siRNA表达载体。它们不同程度地抑制了乳腺癌细胞Livin基因的表达,以si-Livin2抑制效率最高。si-Livin2作用于人乳腺癌细胞株MCF-7和ZR-75-30后能明显抑制其Livin基因的mRNA及蛋白表达水平(P<0.05),并且能有效抑制细胞的增殖。结论Livin-siRNA能特异性抑制乳腺癌细胞的Livin mRNA及其蛋白的表达,抑制细胞增殖,为进一步研究沉默Livin基因对人乳腺癌细胞生物学功能的影响奠定了基础。

siRNA沉默Livin基因对胃癌细胞生长、凋亡的影响

目的:观察小分子干扰RNA(siRNA)沉默Livin基因在胃癌BGC-823细胞中的表达,并探讨Livin基因对胃癌细胞生长、凋亡的影响.方法:自行设计两条针对Livin基因的siRNA:Livin-sh-1和Livin-sh-2,以此构建相应的表达载体并分别转染至对数生长期胃癌BGC-823细胞,经G418筛选后分别采用半定量RT-PCR检测不同siRNA实验分组细胞BGC-823mRNA水平变化,四氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖、流式细胞仪检测胃癌细胞的凋亡.结果:siRNA对照组与空siRNA载体组Livinα/βmRNA表达差别无显著性;但转染siRNA组Livinα/βmRNA表达显著低于空白对照组和空siRNA载体组(Livinα:0.11±0.07vs0.37±0.10,0.34±0.08;Livinβ:0.13±0.04vs0.43±0.09,0.45±0.11,均P<0.05).空白对照组与空siRNA载体组相比,24、48、96h和1wk时细胞生长未受影响;而siRNA组在转染后24h和48h细胞生长未受影响,但在96h和1wk时则被明显抑制(P<0.01).转染siRNA组的细胞的凋亡率与空白对照组和转染空siRNA载体组相比显著增加(14.85%±1.35%vs4.51%±0.36%,6.13%±0.71%,均P<0.05).结论:siRNA沉默Livin基因能抑制胃癌细胞的生长,促进胃癌细胞的凋亡,Livin基因有可能成为胃癌治疗的新靶点.

乳腺癌中Livin基因及蛋白表达与细胞凋亡、增殖的关系

目的探讨Livin在乳腺癌表达及其与caspase-3蛋白表达和细胞增殖的相互关系。方法采用SP法免疫组化和原位杂交技术检测Livin在正常乳腺组织(14例)、乳腺增生性病变(14例)、乳腺非浸润性癌(20例)和乳腺浸润性癌组织(52例)中Livin mRNA和其蛋白的表达以及caspase-3、Ki-67在乳腺癌组织中的表达。结果Livin蛋白和mRNA在正常乳腺组织、乳腺增生性病变、乳腺非浸润性癌和乳腺浸润性癌组织中阳性率分别为(7.1%、7.1%)、(28.6%、28.6%)、(65.0%、70.0%)、(73.1%、75.0%),差异有统计学意义(P<0.01)。Livin蛋白与mRNA表达之间差异无统计学意义(P>0.05)。Livin表达与临床分期、淋巴结转移和年龄有关(P<0.05),与肿瘤大小和组织学分级无关。Livin蛋白与caspase-3的在乳腺癌表达呈负相关(P<0.01)。Livin蛋白表达阳性的乳腺癌Ki-67增殖指数(47.32%±22.34%)明显高于Livin蛋白表达阴性的乳腺癌Ki-67增殖指数(18.01%±23.34%)(P<0.01)。结论Livin基因及蛋白在乳腺癌中表达上调,提示在乳腺癌发生、发展中起重要作用,可作为乳腺癌新的分子标记物,可能成为乳腺癌诱导凋亡治疗的新靶点。Livin蛋白通过与执行型caspase-3结合,抑制其活性,从而阻止细胞凋亡。Livin不仅参与细胞凋亡的调控,还促进了细胞增殖及肿瘤的发生、发展。

两种铂类药物对人胃癌细胞Livin基因表达的影响

目的:研究奥沙利铂(L-OHP)或顺铂(CDDP)对人胃癌细胞株BGC-823生长的抑制作用以及Livin基因表达的变化。方法:应用MTT比色法检测细胞24、48、72h的增殖抑制率,选择3个时间段的不同浓度(IC10、IC30、IC50)铂类药物作用于BGC-823细胞,RT-PCR法检测Livin基因表达,Western-blots法检测Livin蛋白表达量。结果:两种铂类药物作用后,BGC-823的增殖受到抑制,呈时间和剂量依赖性,L-OHP的量效变化更明显。两种铂类药物早期均可抑制Livin表达,CDDP作用细胞72h后Livin表达量开始增加,而L-OHP组仍呈下降趋势。结论:L-OHP是Livin的潜在抑制剂,其对BGC-823的增殖抑制量效变化比CDDP更明显,两者对Livin表达的不同影响将为探讨Livin的调控机制和功能研究提供一定依据。

Livin基因在儿童急性白血病中的表达及其意义

目的观察Livin基因在急性白血病患儿白血病细胞中的表达及其意义。方法采用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测31例ALL及22例AML患儿白血病细胞Livin mRNA的表达水平,并以12例非白血病患儿为对照组。结果急性白血病(AL)患儿白血病细胞Livin mRNA阳性表达率为60.3%。ALL组和AML组Livin mRNA阳性表达率分别为61.3%和59.1%,两者比较差异无统计学意义,但均高于非白血病对照组(8.3%),并且Livin mRNA阳性患儿的缓解率明显低于阴性患儿的缓解率。结论 Livin基因的过度表达与AL的发病具有相关性,可作为AL的诊断、复发及预后判断的指标之一。

SiRNA沉默livin基因表达促进胃癌细胞凋亡

目的:研究livin特异性小分子干扰RNA (siRNA)沉默胃癌SGC-7901细livin基因及对促胃癌细胞凋亡的影响。方法:设计针对人源livin基因的两条SiRNA:si-livin1和si-livin2,分别转染至对数生长期的胃癌SGC-7901细胞:逆转录酶链式反应(RT- PCR)检测转染前后胃癌SGC-7901细胞livin基因表达的变化,MTT法检测转染前后该细胞对5-FU、顺铂的半数抑制浓度(IC50)的变化以及检测转染前后细胞增殖能力的变化,PI染色后流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡的变化。结果:livin特异性siRNA转染胃癌SGC-7901细胞48h后,si-livin1组livinαmRNA(灰度值表示)表达较空白对照组和阴性对照组显著减少(livinα:0.167±0.013 vs 0.403±0.036,0.389±0.053;livinβ:0.181±0.028 vs 0.413±0.041,0.404±0.029,均尸<0.01),而si-livin2组livin mRNA表达相比于空白对照组和阴性对照无显著差异;转染siRNA后,si-livin1组胃癌细胞生长缓慢,生长曲线较对照组平缓;si-livin1组细胞对5-FU和顺铂半数抑制浓度IC50较空白对照组和阴性对照组显著降低(5-FU:34.07±2.98 vs 74.39±4.91,69.85±4.57;顺铂:4.56±0.35 vs 9.07±0.44,7.96±0.64,均P<0.01);转染siRNA后,si-livin1组胃癌细胞自发凋亡率较空白对照组和阴性对照组增加(11.07±1.36 vs 3.54±2.89,6.72±1.77,P<0.01,P<0.05).5-FU和顺铂作用后,si-livin1组胃癌细胞凋亡率较空白对照组和阴性对照组显著增加(5-FU:34.90±1.76 vs 11.54±O.83,13.54±2.55;顺铂:48.14±2.70 vs 14.51±0.35,15.71±0_34,均P<0.01).结论:RNA干扰可有效沉,livin基因表达从而抑制胃癌SGC-7901细胞生长及增加该细胞凋亡敏感性,livin可能成为胃癌凋亡治疗途径的一个分子靶点。

RNA干扰Livin基因表达增强骨肉瘤MG-63耐药细胞对多柔比星的化疗敏感性

目的:研究凋亡抑制蛋白基因Livin在逆转骨肉瘤耐药中的作用。方法:应用多柔比星逐步诱导法诱导人骨肉瘤MG-63细胞建立耐药细胞株,MTT实验检测耐药细胞株的耐药指数,Western blotting法检测MG-63细胞和耐药细胞中Livin蛋白表达的差异。构建Livin shRNA真核表达载体,应用LipofectmineTM2000转染至耐药骨肉瘤细胞中,Real-time PCR和Western blotting分别检测Livin shRNA转染前后MG-63耐药细胞中Livin基因和蛋白表达的变化,流式细胞术检测细胞凋亡的变化,MTT法检测对多柔比星化疗敏感性的变化。结果:成功构建重组质粒p Silencer3.1-H1 neo-Livin si。诱导的耐药细胞MG-63/R对多柔比星的耐药指数为81.32±5.33。Livin shRNA可抑制MG-63细胞中Livin基因和蛋白表达,明显低于空白对照组和非特异性转染组(分别下调72%和69%,P<0.05)。特异性转染Livin shRNA组MG-63/R细胞的凋亡率显著高于未转染组和非特异性转染组[(22.4±3.2)%vs(4.2±1.1)%、(4.7±0.6)%,P<0.05]。3组细胞在加入多柔比星后增殖均受到不同程度的抑制,且呈明显的时间-效应关系,但特异性转染组细胞的存活率均显著低于其他两组(P<0.05)。结论:应用RNA干扰技术下调Livin的基因表达可有效促进耐药MG-63骨肉瘤细胞的凋亡,从而增加其对化疗药物的敏感性。

livin基因在卵巢癌细胞中的表达及其意义

目的探讨凋亡抑制基因livin在卵巢癌细胞中的表达及其生物学意义。方法收集32例卵巢癌患者癌组织及相应的癌旁组织、细胞培养卵巢癌细胞系A2780,用实时荧光定量PCR和westernblot分别检测组织中livin基因的mRNA和蛋白质表达;MTT法检测A2780细胞的生长率;流式细胞术检测A2780细胞的凋亡率。结果 livinmRNA和蛋白质表达在卵巢癌组织中明显高于癌旁组织(t=6.98,P<0.01;t=5.12,P<0.01);与对照组相比,转染livinsiRNA组卵巢癌细胞的生长率显著减少(χ2=77.21,P<0.01),细胞凋亡率呈明显增高(χ2=15.68,P<0.01)。结论 livin在卵巢癌的发生、发展中起重要的作用,可能成为卵巢癌治疗的新分子靶点。

siRNA沉默Livin基因对乳腺癌MCF-7细胞化学治疗增敏作用的研究

目的观察小干扰RNA(siRNA)沉默Livin基因对人乳腺癌细胞MCF-7细胞生物学影响及siRNA沉默MCF-7细胞Livin基因对4种化学治疗药物的增敏作用。方法 Lipofectamine 2000脂质体转染法转染MCF-7。分组:空白组(无转染)、脂质体组、反义组、错义组、联合组。MTT法测定氟尿嘧啶(5-FU)、表柔比星(EPI)、多西紫杉醇(DXT)、吉西他滨(GEM)单药(单药组)对乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用。免疫组织化学检测Livin蛋白在MCF-7细胞中的表达及转染联合化学治疗药物对Livin蛋白的表达变化。实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测转染Livin siRNA后乳腺癌MCF-7细胞的Livin基因表达变化。同时利用Annexin-V检测乳腺癌细胞的凋亡及siRNA Livin联合5-FU、EPI、DXT、GEM诱导乳腺癌细胞凋亡的影响。结果 Livin在MCF-7细胞中高表达,4种化学治疗药物对Livin表达无明显影响,转染Livin基因48、72h后联合4种药物后能明显下调Livin蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05)。5-FU、EPI、DXT、GEM治疗乳腺癌MCF-7细胞48、72h均能明显的引起细胞的凋亡,且呈剂量依赖性。转染Livin基因48h联合4种药物后乳腺癌MCF-7细胞的凋亡率明显高于单药处理的细胞,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 siRNA沉默Livin基因能促进由化学治疗药物5-FU、EPI、DXT、GEM引起的细胞凋亡,具有化学治疗增敏作用。

Livin基因在恶性肿瘤诊断和治疗中的研究进展

Livin作为凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)的成员之一,表达于多种恶性肿瘤细胞中,而且其过表达可增加恶性肿瘤细胞的抗凋亡作用及对放疗化疗的耐受性。

新发现的Livin基因在结直肠癌组织中mRNA表达及其临床意义

目的研究Livin基因在结直肠癌组织表达及其意义。方法采用逆转录聚合酶链式扩增反应对30例结直肠癌组织3、0例癌旁正常组织及10例正常成人大肠组织中Livin mRNA的表达进行检测。结果10例正常成人大肠组织中Livin基因均无表达。结直肠癌及癌旁正常组织Livin基因表达阳性率均为100%,但癌旁正常组织Livin基因表达量较癌组织表达量明显下降,(P<0.05),Livin基因表达量与患者的年龄、性别、肿瘤的分期、分级差异无统计学意义(P>0.05)。结论Livin基因表达升高与结直肠癌密切相关,可能参与结直肠癌的发生。

长春新碱对非小细胞肺癌中Livin基因表达的影响

目的:研究化疗药物长春新碱(Vincristine,VCR)对人肺癌细胞株A549生长的抑制作用以及Livin基因表达的变化。方法:将VCR按100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78μg/ml浓度加入A549后,分别作用24、48、72小时,用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖抑制率;实时荧光定量PCR检测LivinmRNA的表达,免疫印迹法(Westernblot法)检测Livin蛋白的变化。结果:VCR对A549具有一定增殖抑制作用,呈时间和剂量依赖性。VCR早期可抑制A549中Livin基因表达,作用72h后Livin基因表达量开始增加。结论:VCR可抑制A549肺癌细胞的增殖,在一定时间内呈剂量、时间依赖性。VCR可能诱导了Livin基因的表达,Livin可能参与了肺癌细胞对VCR的耐药机制。。

RNAi沉默livin基因对裸鼠移植瘤生长及Ki67蛋白表达的影响

目的利用慢病毒携带的livin基因短发夹RNA(shRNA)干扰裸鼠移植瘤中Livin蛋白表达,探讨其对肺腺癌裸鼠移植瘤生长及Ki67蛋白表达的影响。方法建立肺腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,待移植瘤长至100mm3左右时,以携带livin基因shRNA慢病毒载体注入移植瘤,观察肿瘤生长情况。用免疫组织化学方法检测各组Livin蛋白、Ki67蛋白表达,分析二者相关性。结果 livin基因shRNA干预组与空白对照组和阴性载体对照组相比,瘤体生长减缓,移植瘤质量明显减小(P<0.01),Livin蛋白、Ki67蛋白的表达明显降低(P<0.01,P<0.01),且Livin蛋白与Ki67蛋白的表达呈正相关(r=0.54,P<0.01)。结论利用livin基因shRNA可抑制移植瘤生长,Livin蛋白表达明显降低,Ki67蛋白的表达也降低,两者呈显著正相关。

反义寡核苷酸对淋巴瘤细胞Livin基因表达及细胞凋亡的影响

目的分析凋亡抑制蛋白Livin基因的反义寡核苷酸(ASODN)对人淋巴瘤细胞株(Raji)Livin mRNA表达的抑制作用及其对细胞凋亡的影响。方法合成Livin特异性全硫代修饰的ASODN及其对照错义寡核苷酸(MSODN),通过脂质体转染Raji细胞,MTT法检测细胞的增殖抑制率;RT-PCR法检测转染前后Livin mRNA表达水平的变化;Hoechst染色观察细胞凋亡的形态学改变;流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果 Livin ASODN能显著抑制Raji细胞的增殖(P<0.01),并呈现一定的剂量效应关系。0.6μmol/L的ASODN作用Raji细胞48h后,Livin mRNA的表达水平明显下调,细胞出现凋亡的形态学改变,细胞凋亡率为(37.54±2.65)%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 Livin ASODN能有效降低Livin mRNA表达水平,抑制Raji细胞增殖,并增强细胞凋亡的敏感性,有望成为淋巴瘤基因治疗的分子靶向。

siRNA沉默livin基因对结肠癌细胞5-氟尿嘧啶和奥沙利铂药物敏感性的影响

目的 探讨siRNA沉默livin基因对结肠癌细胞5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)和奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)敏感性的影响。方法 构建含livin-siRNA序列的稳定表达质粒,通过Lipofectamine TM 2000转染至结肠癌CT-26细胞株,转染后筛选出稳定和低表达livin的结肠癌细胞(livin-siRNA组),同时设空白对照组(mock组)和转染阴性对照组(control siRNA组)。应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测CT-26细胞中livin的mRNA和蛋白表达;流式细胞术检测各组CT-26细胞凋亡情况;MTT法检测CT-26细胞对5-Fu和 L-OHP 的敏感性。结果 转染livin-siRNA后,CT-26细胞中的livin mRNA和蛋白量较mock组和control siRNA组明显降低(P<0.05);转染48 h后,livin-siRNA组CT-26细胞凋亡率明显高于mock组和control siRNA组(P<0.05)。转染后livin-siRNA组的CT-26细胞较mock组和control siRNA组对5-Fu和L-OHP的敏感性显著增加(P<0.05)。结论 通过干扰RNA沉默livin基因可促进肿瘤细胞凋亡,增加结肠癌CT-26细胞对5-Fu和 L-OHP 药物的敏感性。

Livin基因siRNA慢病毒表达载体的构建及其对喉癌细胞HEP-2增殖的影响

目的构建及鉴定Livin基因siRNA慢病毒表达载体并观察其对喉癌细胞HEP-2增殖的影响。方法从基因库获得Livin基因序列,设计3段siRNA序列;经MluⅠ和ClaⅠ双酶切后克隆入慢病毒表达载体p Len OR-THM,构建p Len OR-THMLivin-siRNA重组质粒,将其转化感受态细菌DH5α,对阳性克隆进行筛选后,用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切及测序鉴定正确后用脂质体转染293T细胞包装病毒颗粒,感染293T细胞及HEP-2细胞,用荧光定量PCR检测其对HEP-2增殖的影响。结果慢病毒表达载体p Len OR-THM-Livin-siRNA被成功构建;转染293T细胞组装病毒液有绿色荧光,并主要表达在细胞膜上;浓缩后的病毒液感染293T细胞及HEP-2细胞均有绿色荧光表达。SH2-R组的Livin蛋白相对表达量最低为(12.31±4.43)%;SH2-R组与SH2-F、NC组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了Livin基因siRNA慢病毒载体;HEP-2细胞Livin蛋白表达受到抑制。

Livin基因与宫颈癌前病变及宫颈癌关系的研究

目的探讨凋亡抑制基因Livin与宫颈癌前病变及宫颈癌的关系。方法 64例宫颈癌、56例宫颈上皮内瘤变和32例正常宫颈患者作为研究对象。用免疫组织化学SABC法进行Livin基因表达检测,比较三者之间表达的差异,探讨Livin表达与正常宫颈、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌患者的病理相关关系。结果宫颈癌、宫颈上皮内瘤变及正常宫颈组织中Livin的表达率分别为70.3%(45/64)、57.1%(32/56)、0(0/32),三者比较差异有统计学意义(P<0.05)。Livin在宫颈癌组织与宫颈上皮内瘤变组织中的表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。Livin基因表达与宫颈癌的淋巴结转移及宫颈癌的临床分期具有相关性(r=0.56、0.52,P<0.05)。Livin基因表达与宫颈癌的病理分型、病理分级、患者年龄无明显相关性(P>0.05)。结论 Livin基因在宫颈癌的发生中具有抑制肿瘤细胞凋亡的作用,可以做为宫颈癌诊断及预后的相关指标。