miRNA-99b、LL-37、IP-10在耐多药肺结核患者中表达及早期疗效预测价值

目的 分析微小RNA-99b(miRNA-99b)、抗菌肽LL-37、干扰素-γ诱导蛋白10(IP-10)在耐多药肺结核(MDR-PTB)患者中表达及早期疗效预测价值。方法 研究纳入医院2022年11月-2024年2月临床收治MDR-PTB患者108例为MDR-PTB组,Bandim TBscore评分法将其划分为轻度组(n=71)与中-重度组(n=37);纳入同期非耐药肺结核患者(DS-PTB)87例为DS-PTB组,健康体检志愿者90例为健康对照组,检测、评估组间miRNA-99b、LL-37、IP-10表达水平及治疗8周后临床疗效,采用Pearson评估miRNA-99b、LL-37、IP-10表达水平与MDR-PTB患者临床疗效相关性,指标预测价值行多因素Logistic回归,作ROC曲线分析模型预测价值。结果 MDR-PTB组miRNA-99b、LL-37、IP-10均高于DS-PTB组与健康对照组(P<0.05),且DS-PTB组miRNA-99b、LL-37、IP-10高于健康对照组(P<0.05);MDR-PTB组内,中-重度组miRNA-99b、LL-37、IP-10表达水平均高于轻度组(P<0.05);治疗4周、治疗8周后,MDR-PTB患者miRNA-99b、LL-37、IP-10均低于治疗前(P<0.05);108例MDR-PTB患者经8周治疗后临床有效率为88.89%;miRNA-99b、LL-37、IP-10均与有效率呈负相关关系(r=-0.693、-0.706、-0.497,P<0.05);miRNA-99b、LL-37、IP-10高水平表达为MDR-PTB发生发展独立危险因素,有统计学意义(P<0.05),ROC曲线分析显示,miRNA-99b、LL-37、IP-10联合检测AUC为0.937(95%CI:0.863~0.974)高于单一检测结果(Z=7.691、7.069、8.068,P均<0.001);且联合检测敏感度(96.91%)与特异度(96.34%)均最高。结论 miRNA-99b、LL-37、IP-10高水平表达参与MDR-PTB发生与发展,三项联合在MDR-PTB患者早期疗效预测中应用价值高。

足三里穴位注射黄芪注射液联合肺康复训练对老年慢性阻塞性肺疾病病人抗菌肽LL-37和免疫功能的影响

目的 研究足三里穴位注射黄芪注射液联合肺康复训练对老年COPD稳定期病人的疗效、血清抗菌肽LL-37水平、炎症因子及外周血T淋巴细胞亚群的影响。方法 选择98例老年COPD稳定期病人,根据治疗方法分为黄芪组(50例)和对照组(48例)。对照组予以肺康复训练及常规西药治疗,黄芪组在对照组基础上予以足三里穴位注射黄芪注射液,疗程均为12周。比较2组治疗前后肺功能、6分钟步行试验(6MWT)结果、改良版英国医学研究委员会呼吸问卷(mMRC)呼吸困难程度分级,血清抗菌肽LL-37、TNF-α、IL-6、CRP水平及T淋巴细胞亚群变化。结果 2组治疗后肺功能(FVC、FEV1、FEV1%pred、FEV1/FVC)、6MWT结果及mMRC分级均较治疗前明显改善(P<0.05),且黄芪组较对照组改善更为明显(P<0.05)。2组治疗后血清抗菌肽LL-37、CD3^(+)T淋巴细胞、CD4^(+)T淋巴细胞及CD4^(+)/CD8^(+)水平均较治疗前升高,且黄芪组高于对照组(P<0.05);2组治疗后TNF-α、IL-6、CRP水平均低于治疗前,且黄芪组低于对照组(P<0.05)。结论 足三里穴位注射黄芪注射液联合肺康复训练可改善老年COPD稳定期病人的肺功能和运动耐力,提高血清抗菌肽LL-37水平并改善免疫功能。

内源性抗菌肽LL-37在疾病中的研究进展

抗菌肽(antimicrobial peptide,AMP)是多细胞生物分泌的多肽类物质,人体内源性AMP主要包括防御素家族和Cathelicidins家族,其中Cathelicidins被发现具有抗菌、抗病毒作用及免疫活性。人体内的Cathelicidins被称为人阳离子抗菌肽18(human catinic antimicrobial peptide-18,hCAP-18),其在体外剪切后成为AMP LL-37发挥生物学活性。本文对人内源性AMP LL-37在多种疾病中的作用及研究进展作一综述,以期为LL-37的临床转化及应用提供依据。

新生儿败血症LL-37、MCP-1、IL-10表达变化与病情程度的关系及对预后的预测价值

目的:探讨新生儿败血症(NS)血清抗菌肽-37(LL-37)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-10(IL-10)表达变化与病情程度的关系及对预后的预测价值。方法:选取我院2020年7月—2022年7月收治的99例NS患儿为研究对象,根据小儿危重病例评分法评分将患儿分为非危重组(43例,>80分)、危重组(24例,71~80分)和极危重组(32例,≤70分)。比较3组治疗前血清LL-37、MCP-1、IL-10水平,并分析其与小儿危重病例评分法评分的相关性,比较不同预后患儿治疗前、治疗1周后血清LL-37、MCP-1、IL-10水平,偏回归分析NS预后不良的影响因素,ROC分析治疗前、治疗1周后血清各指标联合检测对NS预后不良的预测价值。结果:治疗前3组血清LL-37、MCP-1、IL-10水平比较:非危重组<危重组<极危重组,且其水平与小儿危重病例评分法评分均呈负相关(P<0.05);治疗前、治疗1周后预后不良组血清LL-37、MCP-1、IL-10水平高于预后良好组(P<0.05),且以上指标是影响预后的危险因素;治疗前、治疗1周后血清LL-37、MCP-1、IL-10水平联合预测NS预后不良的AUC分别为0.735、0.811。结论:血清LL-37、MCP-1、IL-10水平与NS病情危重程度和病情转归有密切联系,可作为判断病情危重程度的有效指标,并可为临床早期预测不同预后情况提供参考。

黄芪、穿心莲单独或与抗菌肽LL-37联合应用对铜绿假单胞菌生物膜的影响

【目的】探讨黄芪、穿心莲对铜绿假单胞菌(PA)生物膜的抑制作用及与抗菌肽LL-37联合应用是否有协同作用。【方法】培养铜绿假单胞菌野生菌株PAO1生物膜,并采用紫外分光光度法进行鉴定。采用微量肉汤稀释法分别检测黄芪、穿心莲和抗菌肽LL-37对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)。采用紫外分光光度法检测20、50、100 g/L黄芪,20、50、100 g/L穿心莲单独用药或分别与32、64μg/mL抗菌肽LL-37联合应用对PAO1生物膜的作用。【结果】成功构建体外PAO1生物膜模型。黄芪、穿心莲在3.125～200 g/L浓度范围内对PAO1无抑制作用。抗菌肽LL-37对PAO1的MIC为256μg/mL。黄芪、穿心莲单独用药对PAO1生物膜早期形成均具有抑制作用(P<0.05),呈现浓度依赖性。黄芪/穿心莲与抗菌肽LL-37联合用药对PAO1生物膜的形成及对成熟生物膜的清除作用不明显,不具有协同作用。【结论】黄芪、穿心莲均能够早期抑制PAO1生物膜的形成并且在一定程度上对成熟生物膜结构有一定的破坏作用;与抗菌肽LL-37联合应用时,不具有协同作用。

儿童反复上呼吸道感染补充维生素D后LL-37水平的变化研究

背景流行病学调查显示全球大约有10亿人存在维生素D缺乏或不足,我国维生素D缺乏尤为严重。反复上呼吸道感染作为小儿常见病及多发病,严重影响小儿身心健康,维生素D缺乏是导致抗菌肽LL-37下调的主要原因,因此维生素D缺乏越来越引起人们的重视。目的探讨反复上呼吸道感染患儿补充维生素D后LL-37水平变化。方法选取2017年5-11月河北大学附属医院门诊就诊的反复上呼吸道感染并存在维生素D不足或缺乏的患儿54例,采用随机数字表法分为试验组及对照组,每组各27例。试验组给予常规治疗联合补充维生素D,对照组给予常规治疗联合安慰剂,随访12个月,记录治疗前和治疗后12个月时上呼吸道感染次数,检测血浆25-羟维生素D3及痰上清LL-37的变化。结果 45例患儿完成了随访,试验组23例,对照组22例。治疗前,两组患儿上呼吸道感染次数、血浆25-羟维生素D3及痰上清LL-37水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);治疗后12个月,试验组患儿上呼吸道感染次数少于对照组,血浆25-羟维生素D3、痰上清LL-37水平高于对照组(P<0.05)。对照组患儿治疗前后上呼吸道感染次数、血浆25-羟维生素D3及痰上清LL-37水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);试验组患儿治疗后12个月上呼吸道感染次数少于治疗前,血浆25-羟维生素D3、痰上清LL-37水平高于治疗前(P<0.05)。Pearson直线相关分析结果显示,试验组治疗后12个月血浆25-羟维生素D3与痰上清LL-37呈正相关(r=0.505,P<0.05)。结论补充维生素D有助于减少反复上呼吸道感染患儿上呼吸道感染次数,这种作用可能与LL-37产生增加有关。

抗菌肽LL-37在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性鉴定

为获得高效表达的抗菌肽LL-37,根据人源抗菌肽LL-37的氨基酸序列,选择毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法改造合成LL-37基因片段,克隆到pGAPZαA质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pGAPZαA-LL-37。pGAPZαA-LL-37通过限制性内切酶AvrII酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞SMD1168。经Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测表明LL-37基因与毕赤酵母染色体稳定结合。在GAP启动子调控下,LL-37蛋白获得分泌表达,其上清表达量约为237mg/L。表达产物耐热性强,在100℃条件下30min内仍保持一定的抗菌活性。表达产物对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌D31和猪链球菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为1.56μg/mL、3.12μg/mL和6.25μg/mL。

人源抗菌肽LL-37在毕赤酵母中的高效表达及其活性检测

根据GenBank CAA86115中的LL-37氨基酸序列,选择毕赤酵母偏好密码子,采用SOE方法合成了人源抗菌肽LL-37基因。所合成的LL-37基因全长为141bp,并在其N端引入kex2裂解位点,以保证表达抗菌肽具有天然N端。基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-LL-37。pPICZα-A-LL-37经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导分泌LL-37于发酵上清液,其表达量为206mg/L。表达产物LL-37耐热性强,在100℃条件下40min内抗菌活性不变,煮沸3h以上仍具有活性。琼脂糖孔穴扩散法检测显示LL-37对多种革兰氏阴性菌和阳性菌均具有很好的抑制活性,其对金黄色葡萄球菌CowanⅠ(Staphylococcus aureus)、致病性大肠杆菌K99(Enteropathogenic E.coli)和鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)的最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)分别为1.56μg/mL、3.12μg/mL和1.56μg/mL。

人源抗菌肽LL-37

LL 3 7是迄今在人体中发现的抗菌肽cathelicidin家族中的唯一成员 ,也是人体内唯一的双亲性α螺旋结构的抗菌肽 .LL 3 7在人体的血液细胞和上皮细胞中广泛分布 ,具有广谱抗菌作用 .抗菌活性依赖其螺旋构象的形成 ,通过“地毯样”机制杀灭细菌 .LL 3 7有中和内毒素的作用 ,能与LPS和CD14结合 ,中和LPS的生物活性 ,还能利用formylpeptidereceptor like 1(FPRL1)作为受体介导趋化作用 ,招募免疫细胞到感染部位 ,清除病原物 .很多感染性疾病都与LL 3 7低表达或功能失活有关 .LL 3 7是一种多功能的抗菌肽 。

人源抗菌肽LL-37表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建人源抗菌肽LL-37的表达载体pPIC9-LL-37,将其转化毕赤酵母GS115,诱导LL-37表达。方法:根据抗菌肽LL-37氨基酸序列及毕赤酵母偏爱密码子,应用互补延伸PCR技术扩增抗菌肽LL-37基因,定向克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9上,转化E.coli DH5a.构建重组分泌型酵母表达载体pPIC9-LL-37.PCR鉴定并测序;原生质球法转化毕赤酵母GS115.PCR扩增鉴定:甲醇诱导LL-37表达,筛选最高表达株.检测表达产物对大肠杆菌的抑菌活性,并对其进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹分析。结果:pPIC9-LL-37载体构建成功:转化毕赤酵母后PCR鉴定出LL-37基因:0.5%甲醇能诱导LL-37高表达,筛选出最高表达株,发酵上清约含LL-37 0.5μg/ml,对E.coli具有较强的抑菌活性,电泳及Western印迹分析证实表达产物为LL-37。结论:成功构建pPIC9-LL-37载体.转化毕赤酵母后.经甲醇诱导能高表达分泌LL-37,表达的LL-37蛋白具有较强的抑菌活性。

LL-37对COPD模型大鼠Th17/Treg平衡及炎症反应的调节作用

目的观察人源抗菌肽LL-37对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)平衡、炎症反应的影响,并探讨可能机制。方法40只Wistar大鼠随机分为正常组、COPD组、LL-37组、LL-37联合DAPT(Notch1/Jagged1信号通路抑制剂)组。正常组室温下正常喂养,COPD组、LL-37组、LL-37联合DAPT组采用烟熏法建立COPD模型。LL-37组大鼠经鼻滴入LL-37(10μg)50μL,LL-37联合DAPT组大鼠经鼻滴入总体积50μL的LL-37(10μg)+DAPT(10μg)。正常组、COPD组大鼠分别经鼻滴入等体积的生理盐水。检测外周血Th17、Treg细胞占比;检测肺泡灌洗液(BALF)中白介素-8(IL-8)、白三烯B4(LTB4)含量;HE染色检测气道重塑指标;Western Blot法检测肺组织Notch1、Jagged1、发状分裂相关增强子1(Hes1)蛋白表达量。结果与COPD组比较,LL-37组外周血Th17占比和Th17/Treg、BALF中IL-8、LTB4含量、管壁厚度/外径(MT%)及管壁面积/气管总面积(MA%)均降低,Treg占比升高(P<0.05);与LL-37组比较,LL-37联合DAPT组外周血Th17占比和Th17/Treg、BALF中IL-8、LTB4含量、MT%及MA%均升高,Treg占比降低(P<0.05)。与COPD组比较,LL-37组Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表达量升高(P<0.05);与LL-37组比较,LL-37联合DAPT组Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表达量降低(P<0.05)。结论人源抗菌肽LL-37可调节COPD大鼠外周血Th17/Treg失衡,抑制炎症反应及气道重塑,激活Notch1/Jagged1信号通路可能是其发挥治疗作用的机制之一。

葡萄糖对水性可降解聚氨酯装载抗菌肽LL-37抑制体外尿源性ESBLs大肠埃希菌生物膜形成的影响

目的:探讨葡萄糖浓度变化对水性可降解聚氨酯(biodegradable waterborne polyurethane,BWPU)装载人源抗菌肽LL-37体外抑制ESBLs大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)生物膜活性的影响。方法:采用尿源性ESBLs E.coli临床株(E44)为实验株,E.coli标准菌株ATCC25922(E0)做质控。构建胱细菌生物膜动态孵育模拟系统。"两步法"制备新型LDI-BWPU乳液PCLPU33。"物理溶解和常温干燥法"制备LDI-BWPU装载不同LL-37浓度的载肽膜。设立4个实验分组:H组:高肽组(LL-37,2 000μg/m L)、L组:低肽组(LL-37,250μg/m L)、P组:阳性对照(亚胺培南,8μg/m L)、N组:阴性对照(无抗菌药),持续感染人工尿液环境下孵育48 h,观察不同葡萄糖浓度(0、11.1、33.3 mmol/L)及控制葡萄糖浓度(33.3→0 mmol/L)对载肽膜抑制生物膜的影响。检测方法包括:生物膜细菌活菌计数;Syto-9/PI荧光染色结合激光共聚焦显微镜构建立体图测量生物膜厚度;扫描电镜观察生物膜结构的细微观。生物膜细菌活菌计数和生物膜厚度的多组间均数比较采用单因素方差分析,α=0.01。结果:基于胱细菌生物膜动态孵育模拟系统,在持续感染人工尿液环境下不同葡萄糖浓度观测点,P、H、L组生物膜活菌计数和厚度均明显低于N组(~aP=0.000)。H组生物膜活菌计数在无糖环境(G0 mmol/L)明显低于L组(b P=0.000),在含糖环境下(G11.1,33.3 mmol/L)与L组差异无统计学意义(P>0.01);H组生物膜厚度在不同葡萄糖观测点均明显低于L组(~bP=0.000)。与无糖环境(G0 mmol/L)相比,含糖环境(G11.1,33.3 mmol/L)H、L组生物膜活菌计数和生物膜厚度均明显增加(~cP=0.000)。调控葡萄糖浓度后(33.3→0mmol/L),H、L组BF细菌活菌计数和生物膜厚度均明显降低(~dP=0.000)。结论:持续感染人工尿液环境下不同葡萄糖浓度时,载肽膜通过抑制生物膜生长、杀灭生物膜细菌明显抑制细菌生物膜形成。

冠心病病人血清LL-37的表达变化及养心氏片的干预作用

目的观察冠心病病人血清LL-37的表达水平,并观察养心氏片对冠心病不稳定型心绞痛病人外周血单个核细胞培养物中LL-37的影响,探讨养心氏抗动脉粥样硬化的可能机制。方法入选2016年6月—2016年12月在大连医科大学附属第二医院心内五科住院的冠心病稳定型心绞痛病人15例,不稳定型心绞痛病人15例,以健康志愿者15名为健康对照组。分别记录入选者的基本信息,检测血脂、超敏C反应蛋白、同型半胱氨酸、β2微球蛋白等指标,并用西雅图心绞痛评分表评估冠心病病人心绞痛稳定程度。用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中LL-37的表达水平。提取不稳定型心绞痛病人外周静脉血中单个核细胞,用10mg/L及50mg/L浓度的养心氏预处理外周血单个核细胞12h,以空白组为对照组,再用50ng/mL佛波酯(PMA)刺激4h,用ELISA法测定细胞上清液中LL-37的浓度。结果冠心病不稳定型心绞痛病人血清LL-37的水平显著高于稳定型心绞痛病人及健康者(P<0.05);健康人群与稳定型心绞痛病人比较差异无统计学意义。冠心病病人的心绞痛稳定程度与血清LL-37水平呈负相关(r=-0.784,P<0.01)。养心氏能降低不稳定型心绞痛病人外周血单个核细胞培养物上清液中LL-37的浓度,其中50mg/L组LL-37浓度最低(253.77±22.26)ng/mL,对照组为(402.31±18.04)ng/mL,10mg/L组为(301.54±14.18)ng/mL,差异有统计学意义(P<0.01)。结论血清LL-37水平与冠心病病情稳定性呈负相关,不稳定型心绞痛病人血清LL-37显著升高。养心氏能降低冠心病不稳定型心绞痛病人外周血单个核细胞培养物上清液中LL-37的浓度,表明养心氏可能通过抑制LL-37的表达起到抗动脉粥样硬化作用。

抗菌肽LL-37对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜的抑制作用

目的研究人抗菌肽LL-37对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)生物膜的相关作用,为MRSA的预防治疗以及新药物开发应用提供新策略。方法运用微量肉汤稀释法测定LL-37对临床MRSA菌株的最小抑菌浓度;建立96孔板及6孔板生物膜体外模型;通过结晶紫定量法以及激光共聚焦荧光染色法检测LL-37对MRSA生物膜形成的影响。结果微量肉汤稀释法测得LL-37对临床MRSA菌株的MIC为12.5μmol/L。不同浓度LL-37作用后,结晶紫定量法结果表明1/20 MIC亚抑菌浓度的LL-37即可抑制生物膜形成(P<0.01),且抑制率随用药浓度增加也随之提高,在1/4 MIC条件下生物膜形成抑制率可达到63%。与生理盐水对照组相比,激光共聚焦扫描显微镜下可见,用药组生物膜排列稀疏,厚度变薄,组成菌量明显减少。结论低浓度的LL-37能够抑制MRSA生物膜的形成,并且对成熟生物膜结构也具有一定的破坏作用。

人源LL-37杀菌多肽的改建及原核细胞中表达

目的改良人源杀菌肽LL-37的氨基酸序列,提高其杀菌力,并在原核细菌中表达。方法应用蛋白质分析软件(Anthepro5.0、SWISS-MODEL等),对人源杀菌肽LL-37的氨基酸序列进行二维、三维结构及理化特性分析,将其中部分氨基酸残基进行替换,提高其正电荷,并以人源杀菌肽LL-37的基因序列为模板,进行相应的DNA序列替换,转入表达载体pET-28a(+)于杆菌BL21(DE3)中表达、纯化,并初步研究其抗菌性。结果在维持LL-37空间构象不变的基础上,将Glu16、Asp26、Glu36分别替换为Gln16、Asn26、Gln36,其静电荷由pH7.4时的+5.8提高到+9.0,并且其多肽N端疏水、C端亲水的特性不变。通过Touch-Down PCR法,成功获得改良LL-37多肽的DNA序列,并将重组质粒pET-28a(+)-rLL-37在杆菌BL21(DE3)中表达,改良LL-37多肽成功由强离子交换柱芯Macro-Prep High S纯化,并对G+、G-菌具有一定的抗菌力。结论将杀菌肽LL-37多肽进行氨基酸残基替换并以原核细胞进行融合型表达是可行的,为改良LL-37的大量制备及杀菌活性研究奠定了基础。

人源抗菌肽LL-37在创伤修复中的研究进展

随着全球经济的快速发展,社会冲突、交通事故以及自然灾害的发生越来越频繁,创伤发病率增高,给个人和社会都造成巨大的负担.世界卫生组织调查统计,全球每年因创伤致死者约500万余人,占全部死亡原因的10%.机体的创伤愈合是一个由多种细胞及分子参与的复杂的生理过程,包括炎症期,增殖期,以及组织重塑期[1].LL-37作为关键的信号分子之一,与各类细胞及各种因子相互作用,协调达到平衡状态,有助于创伤修复.研究发现,人源抗菌肽LL-37能抗菌、调节炎症反应[2-4]、促进新生血管发生[5]及上皮再生[6]等,在创伤修复过程中发挥重要作用.本文就LL-37在创伤修复中的研究进展作一总结.

寻常性银屑病患者皮损中抗菌肽LL-37和人β防御素-2mRNA的表达

目的:探讨寻常性银屑病患者皮损中抗菌肽LL-37与人β防御素-2(hBD-2)mRNA的表达。方法:应用逆转录(RT)-PCR方法检测31例寻常性银屑病患者皮损和16例正常人皮肤组织中LL-37和hBD-2mRNA的表达。结果:与正常人皮肤组织相比,寻常性银屑病患者皮损中LL-37和hBD-2mRNA的表达水平明显升高(P<0.001)。结论:寻常性银屑病患者皮损中LL-37和hBD-2mRNA表达水平的上调可能与银屑病患者很少发生皮肤感染等有关。

人源抗菌肽LL-37/hCAP-18真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞MCF-7中的表达

目的构建人源抗菌肽LL-37/hCAP-18的真核表达载体,并在人乳腺癌细胞MCF-7中进行表达。方法以重组质粒pcDNA4.0-LL-37为模板,采用PCR法扩增LL-37/hCAP-18基因,连入pEGFP-c1质粒,构建真核表达载体pEGFP-c1-LL-37,瞬时转染人乳腺癌细胞MCF-7,采用激光共聚焦显微镜观察重组质粒的转染效率,RT-PCR法检测目的基因的表达。结果所构建的抗菌肽LL-37/hCAP-18真核表达载体经双酶切和测序证明构建正确,在瞬时转染MCF-7细胞48h后,目的基因转染效率较高,约为40%,RT-PCR结果显示,重组质粒转染的细胞可扩增出339bp的目的基因条带。结论已成功构建了人源抗菌肽LL-37/hCAP-18的真核表达载体,并在人乳腺癌细胞中获得表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定了基础。

5′-非转录区序列改建提高毕赤酵母表达抗菌肽LL-37

目的:探讨5′-非转录区(5′-UTR)序列改建对毕赤酵母表达外源蛋白LL-37的影响。方法:去除毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9 5′-UTR内GGATCCAA序列,转化E.coli DH5α,构建改良的毕赤酵母分泌表达载体pPIC9-EDIT;PCR鉴定及测序确认后与酵母偏爱密码子编码的LL-37基因片段连接,构建改良的重组表达载体pPIC9-EDIT-LL-37;原生质球法转化毕赤酵母GS115,PCR扩增鉴定后诱导LL-37表达,筛选最佳表达条件,对表达产物进行凝胶电泳和Western印迹分析;比较转入pPIC9-EDIT-LL-37及pPIC9-LL-37后毕赤酵母表达产物的抑菌活性,间接测定改建前后LL-37蛋白表达量的变化。结果:PCR鉴定及测序证实pPIC9-EDIT改建成功,成功构建重组载体pPIC9-EDIT-LL-37;转化毕赤酵母后表达产物PCR鉴定出LL-37基因,最佳诱导甲醇浓度为0.5%,最佳诱导表达时间为72h,电泳及Western印迹分析证实表达产物为LL-37;改建后LL-37蛋白表达量提高了约35倍。结论:pPIC9 5′-UTR序列的改建能明显提高毕赤酵母表达LL-37蛋白,值得进一步研究以应用于其他外源蛋白表达。

LL-37对银屑病患者T细胞分泌白介素-8的作用

目的研究抗菌肽LL-37刺激银屑病患者外周血T细胞分泌白介素-8(IL-8)的作用。方法用酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法检测LL-37刺激前后健康人和银屑病患者外周血中IL-8的表达变化。结果在健康人外周血中,未受LL-37刺激的T细胞不能产生IL-8;在LL-37刺激后,可见IL-8的表达升高,且有时间和剂量依赖性,12h产生IL-8的量最多。在银屑病患者外周血中,未受LL-37刺激的T细胞可产生少量IL-8;LL-37刺激后,可见IL-8的表达升高,8h时IL-8的产生量已经相当于正常细胞12h的产生量,12h产生量更多。结论 LL-37刺激银屑病患者外周血T细胞,其产生IL-8的速度比健康人T细胞更快,剂量更大。