制备抗菌肽LL37修饰的金纳米颗粒及其体外转染和抗菌实验研究

目的 制备抗菌肽LL37修饰的金纳米颗粒(gold nanoparticles, AuNPs)(AuNPs@LL37),并研究其理化性质的表征参数、体外转染效率及其抗菌能力。方法 通过化学还原法和配体交换法制备AuNPs@LL37,紫外分光光度仪检测吸收光谱;纳米粒度仪测定其水合粒径、表面电位(Zeta电位);透射电镜观察其形态特征;超敏型二喹啉甲酸(micro bicinchoninic acid assay, micro BCA)蛋白定量试剂盒测量其表面固定的多肽量;荧光猝灭排除实验检测AuNPs@LL37与质粒DNA的结合情况;细胞计数试剂盒(cell counting kit 8,CCK-8)实验检测AuNPs@LL37的细胞毒性;体外转染实验检测AuNPs@LL37的转染能力;体外抗菌实验检测AuNPs@LL37的抗菌能力。结果 制备得到带正电荷[Zeta电位为(35.40±1.20)mV、直径为(7.10±1.60)nm],表面固定LL37多肽的AuNPs@LL37。当AuNPs@LL37∶pDNA=5∶1时,AuNPs@LL37/pDNA Zeta电位达到正电荷饱和;荧光猝灭排除实验表明,AuNPs@LL37与DNA有较强的结合能力;体外转染实验表明,AuNPs@LL37能够介导增强型绿色荧光蛋白质粒-血管内皮生长因子165(plasmid enhanced green fluorescent protein-vascular endothelial growth factor 165,pEGFP-VEGF165)转染细胞并在细胞中表达绿色荧光蛋白,其转染率可达(89.52±7.36)%;体外抗菌实验表明,AuNPs@LL37和AuNPs@LL37/pDNA均具有杀菌作用。结论 AuNPs@LL37是一种新型的功能化纳米颗粒,既能够作为基因载体又具有抗菌能力。

抗菌肽LL37固体脂质纳米粒的制备、优化和评价

目的制备搭载抗菌肽LL37的固体脂质纳米粒(LL37-SLNs),对配方进行优化、表征和评价。方法采用“乳化蒸发-低温固化”的方法制备17个批次的LL37-SLNs,以硬脂酸、软磷脂和表面活性剂Myrj52作为自变量,平均粒径和包封率作为因变量,通过Box-Behnken试验设计优化配方,并进行表征和评价。结果通过Design Expert 12.0软件对回归方程分析得到最佳配方为硬脂酸300 mg、软磷脂150 mg、Myrj52250 mg。对优化后的LL37-SLNs进行表征和评价,结果显示载药量为(2.92±0.06)%,包封率为(86.87±0.26)%,平均粒径为(221.7±1.3)nm,Zeta电位为(-30.4±0.2)mV,多分散指数为(0.233±0.012)。在透射电镜下观察其外观规则,粒径均一。LL37-SLNs的体外释药曲线表现出良好的缓释能力,体外抗菌活性研究显示出持久的抗菌特性,且在-20℃可稳定储存60 d。结论LL37-SLNs配方合理,颗粒分布均一、稳定,包封率佳,体外释放和抗菌活性良好。

抗菌肽LL37产生及其对炎症性皮肤病作用的研究进展

抗菌肽LL37是目前临床发现的唯一一种人类Cathelidin家族抗菌肽,其可抵御病原体的侵袭,也能够发挥免疫调节、免疫趋化等作用,从而触发或加剧机体炎症反应进程。玫瑰痤疮和银屑病患者体内高表达的LL37可诱导肥大细胞等炎症细胞分泌多种促炎性细胞因子和趋化因子参与皮损的形成。而特应性皮炎患者的LL37表达减少,使机体皮肤屏障功能受损,更易患细菌感染,因此将LL37作为靶点有望成为玫瑰痤疮等炎症性皮肤病治疗的新思路和新手段。本文对LL37的表达过程和调控机制及其在玫瑰痤疮、银屑病和特应性皮炎患者中发挥的作用和相关机制的研究进展进行综述。

抗菌肽LL37联合肽聚糖对单核细胞分化的影响

目的:明确LL37联合肽聚糖(PGN)对单核细胞分化的影响。方法:健康成年人外周血单核细胞经LL37、PGN、LL37+PGN刺激培养,16 h后流式细胞术(FCM)检测细胞表面CD14、CD16、髓系细胞触发受体-1(TREM-1),5天后检测不成熟树突状细胞(iDC)表面标记HLA-DR、CD1a、CD86的表达。诱导形成的iDC与异体淋巴细胞共培养3天,FCM检测Th17细胞的表达,MTT法检测T细胞的增殖。结果:LL37+PGN组与PGN组、LL37组比较,CD14++CD16+单核细胞亚群比例、细胞表面TREM-1表达、iDC比例、T细胞增殖和Th17细胞比例均明显增加,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:LL37联合PGN诱导单核细胞向CD14++CD16+单核细胞亚群极化,最终导致T细胞增殖和向Th17细胞分化。

过表达人抗菌肽LL37腺病毒构建及转染阴道上皮细胞

背景:LL-37作为唯一存在人体的抗微生物肽,不仅能促内皮细胞增殖,而且具有较强的促进血管生成能力,在组织修复初期的血管生成中起重要作用。目的:构建过表达人抗菌肽LL37基因的重组腺病毒,体外转染犬阴道上皮细胞,检测抗菌肽LL37的表达和分泌情况。方法:PCR法扩增LL37基因片段,构建融合绿色荧光蛋白(EGFP)和LL37的重组腺病毒表达质粒,限制性内切酶酶切和测序法鉴定构建的重组腺病毒表达质粒,采用HEK293包装后反复冻融扩增、纯化过表达LL37的腺病毒,终点稀释法检测腺病毒滴度。体外分离培养犬阴道上皮细胞,转染过表达LL37腺病毒,分别于转染后1,2,3,5和7 d采用荧光显微镜观察细胞转染情况,ELISA法测定细胞培养上清液中LL37的分泌表达情况。结果与结论:1限制性内切酶酶切鉴定与DNA测序证实成功构建了GV314-LL37腺病毒表达载体,包装纯化后腺病毒滴度达到3×109 pfu/m L;2犬阴道上皮细胞可在体外成功分离培养并稳定传代;3过表达LL37腺病毒可高效转染阴道上皮细胞,转染24 h后荧光显微镜下即可见绿色荧光蛋白表达,随时间延长表达逐渐增强,转染72 h时表达最强,转染效率达89%;4ELISA证实阴道上皮细胞转染过表达LL37腺病毒后表达分泌LL37,转染后细胞培养上清中LL37表达量显著高于空白组,表达呈时间依赖性,转染3 d表达最强,转染后7 d仍持续分泌表达;5结果说明,成功构建了过表达人抗菌肽LL37基因的重组腺病毒,转染犬阴道上皮细胞后高效表达分泌LL37,为构建具有抗感染能力和促血管生成的功能性组织工程化阴道奠定了基础。

潮霉素抗性基因筛选标记质粒的构建及LL37的表达

为了实现以潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)为选择标记的质粒在毕赤酵母中高效表达抗菌肽LL37,在pGAPZαA质粒的基础上,通过EcoRⅤ、BamHⅠ双酶切将Zeocin抗性基因替换成潮霉素磷酸转移酶基因,获得的表达质粒命名为pGAPHαA。根据LL37氨基酸序列,通过毕赤酵母密码子偏嗜性改造,合成的LL37基因片段克隆到pGAPHαA质粒中,获得重组分泌型表达质粒pGAPHαA-LL37,线性化后电击转化毕赤酵母SMD1168,经潮霉素B筛选阳性转化子。72h表达上清LL37蛋白含量约为167μg/mL,表达产物耐热性好,对大肠杆菌DH5α、猪链球菌最小抑菌浓度分别为2.94、7.06μg/mL。

LL37多肽及其mRNA在口腔扁平苔藓病损表达研究

目的:探讨LL37在口腔扁平苔藓(oral lichen planus,OLP)病损中的表达及在OLP疾病机制中的作用。方法:采用免疫组织化学技术(IHC)和逆转录聚合酶链式技术(RT-PCR)检测25例OLP患者的病变黏膜组织和7例健康对照黏膜组织中LL37蛋白及其mRNA的表达。结果:IHC结果显示,LL37在所有样本中均呈阳性胞质染色,主要表达于棘层和淋巴细胞。25例OLP组口腔病损黏膜均呈强阳性染色,较之健康口腔黏膜组中LL37为弱阳性染色,差异具有显著性(P<0.05);RT-PCR检测结果显示,所有样本均检测出LL37的cDNA电泳条带,健康口腔黏膜组中仅呈微弱表达,而OLP组病损黏膜上皮LL37表达明显增强。结论:LL37可能因炎性诱导呈上调表达而参与OLP的发生发展过程。

pPICZα-LL37-Fcγ1重组质粒的构建及其在毕赤酵母GS115中的表达

目的:构建pPICZα-LL37-Fcγ1重组表达载体,实现LL37-Fcγ1重组融合蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达,获得功能性抗菌蛋白。方法:通过合成LL37全基因,将其与人IgG1Fc(Fcγ1)基因相连后,插入到毕赤酵母菌表达载体pPICZα中。电转化毕赤酵母菌GS115后,经Zeocin抗性筛选阳性菌株。用RT-PCR和斑点杂交鉴定目的基因的表达。通过亲和层析法纯化目的蛋白,并以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。用BCA法测定目的蛋白的浓度,鲎试剂鉴定其中和内毒素的能力。结果:成功地构建了pPICZα-LL37-Fcγ1重组质粒,并证明目的基因已整合于毕赤酵母菌的基因组中。通过亲和层析获得具有结合蛋白A及中和内毒素能力的重组融合蛋白LL37-Fcγ1。结论:在毕赤酵母菌GS115中高效表达功能性的LL37-Fcγ1融合蛋白,为进一步研究奠定了基础。

防御素5和LL37真核重组质粒构建及转染人阴道上皮细胞的研究

目的:构建防御素5(HD5)和LL37的真核重组质粒并瞬时转染人阴道上皮细胞,以期探讨阴道上皮细胞抵抗微生物感染的机制。方法:(1)从人阴道上皮细胞中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出HD5和LL37的cDNA,并将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)-EGFP中,构建重组质粒pcDNA3.1(+)/HD5-EGFP和pcDNA3.1(+)/LL37-EGFP。(2)经组织块法原代培养人阴道上皮细胞并传代,将2种质粒分别或联合转染人阴道上皮细胞,转染6、12、24和48 h后,采用荧光显微镜检测细胞转染情况,ELISA方法测定细胞培养上清液中HD5及LL37的表达情况。结果:成功构建了pcDNA3.1(+)/HD5-EGFP和pcDNA3.1(+)/LL37-EGFP真核表达载体,实现了HD5和LL37在阴道上皮细胞中表达,细胞培养上清中有HD5和LL37蛋白分子表达,且在转染24 h时表达量最高。联合转染组的HD5和LL37水平高于单独转染组,单独转染组高于未转染组,差异均有统计学意义(均P<0.001)。LL37组和联合转染组的LL37水平,联合转染组的HD5水平均是6 h时分泌最低,24 h达高峰,然后呈下降趋势。HD5组的HD5水平随时间增加而呈增加趋势。结论:HD5和LL37成功转染入人阴道上皮细胞并成功表达,为研究重组HD5和LL37的抗菌功能及阴道上皮细胞先天免疫机制奠定了基础。

BPI-LL37抗菌融合蛋白质表达载体的构建与功能鉴定

目的构建杀菌/通透性增加蛋白和LL37抗菌蛋白的融合蛋白（BPI-LL37）表达载体,获得针对脓毒症治疗的多效抗菌融合蛋白,为脓毒症治疗提供新的措施。方法通过PCR方法从杀菌/通透性增加蛋白（bactericidal/permeability-increasing protein,BPI）和LL37基因的c DNA中扩增并修饰获得需要的r BPI21和LL37活性片断,构建r BPI21-LL37/LL37-r BPI21融合蛋白的表达载体,构建的表达载体（p LVX-Tight-Puro）上的BPI和LL37基因之间通过柔性片段（GGSGG）连接。之后使用Poly JetTM体外DNA转染试剂转染人肺腺癌细胞A549。通过Western blot检测真核细胞A549表达融合蛋白的水平,通过抑菌试验验证此融合蛋白的分泌与抗菌能力。结果经限制内酶切酶切、DNA电泳和DNA测序证明融合蛋白表达载体（p LVX-Tight-Puro-BPI-LL-37）构建成功;Western blot检测结果表明融合蛋白r BPI21-LL37/LL37-r BPI21能被真核细胞A549细胞表达,融合蛋白大小介于25～30×10^3;抑菌试验进一步验证此融合蛋白具有抑制细菌生长的生物学效应。结论构建的两种r BPI21-LL37/LL37-r BPI21表达载体能够成功转染入人的体细胞,并表达和分泌具有抗菌活性的融合蛋白,该融合蛋白有潜力成为治疗脓毒症的新药。

Pgp3对抗LL37杀灭沙眼衣原体的作用及机制研究

目的:探讨质粒编码的分泌蛋白Pgp3在沙眼衣原体(Ct)感染宿主过程中的作用及机制,为防治Ct引起的泌尿生殖道感染提供实验依据。方法:构建pGEX-6p/Pgp3原核表达重组质粒并转化XL1-Blue大肠杆菌,IPTG诱导表达GSTPgp3融合蛋白,融合蛋白经亲和层析纯化及GST标签切割后制备Pgp3蛋白。将抗菌肽LL37和Pgp3蛋白共同孵育Ct后感染HeLa细胞,间接免疫荧光技术检测不同处理组Ct包涵体数量。GST pull-down法研究Pgp3与LL37的作用方式及Pgp3的活性片段。结果:LL37与Ct内原体(EB)孵育后感染HeLa细胞,感染率从50%降至10%,不同浓度Pgp3与LL37预先孵育后处理Ct EB再感染HeLa细胞,感染率较LL37组显著升高(P<0.05),且具有剂量依赖性。GST pull-down实验结果显示,LL37可与Pgp3结合,且结合部位位于Pgp3中间段(67~132 aa)。结论:Pgp3在Ct感染宿主过程中通过与人类抗菌肽LL37结合,抑制LL37对Ct的杀伤作用,导致Ct感染。

链球菌脂磷壁酸对人角质形成细胞表达抗菌肽LL37的影响

目的:评价链球菌脂磷壁酸对原代培养的人角质形成细胞表达抗菌肽LL37的影响。方法:以链球菌脂磷壁酸处理原代培养的人角质形成细胞,分别应用逆转录PCR和蛋白印迹法检测角质形成细胞内LL37的表达。结果:经链球菌脂磷壁酸处理后,角质形成细胞内LL37 mRNA和蛋白的表达水平明显升高(P<0.01);预先用抗体封闭细胞表面的Toll样受体2(TLR2)后,LL37的表达较未封闭的脂磷壁酸组下降(P<0.01)。结论:链球菌感染可通过促进人角质形成细胞表达抗菌肽LL37在银屑病的发病中起作用,该作用与TLR2激活有关。

抗菌肽LL37与银屑病

银屑病是一种以红斑、鳞屑为主要表现的慢性炎症性皮肤病,目前认为银屑病的发病机制是具有特定遗传背景(基因)的人群在环境(以感染为主)的作用下,通过天然免疫系统过度活化造成的炎症反应。近期有研究表明,银屑病患者皮肤中存在一种内源性抗菌肽LL37,可以破坏机体对自身DNA的天然耐受,与自身DNA形成一种复合物,运送至浆细胞样树突状细胞(pDC)早期内体单元中,在Toll样受体9(TLR9)的介导下,使机体作出类似于对病毒的反应,产生大量干扰素(IFN)-α,从而引发自身反应性T细胞的活化,继发天然免疫和获得性免疫,导致银屑病皮损的形成。

ll37l抗生素防治腐烂病机理研究

经几年试验研究证明11371抗生素对果树腐烂病有较好的防治效果,是一种比较好的微生物农药。为明确其防病的原因,我们对11371抗生素防治腐烂病的机理作了部份分析研究,现将研究结果报告如下。材料与方法 1、供试材料 11371发酵液:本所提供;福美砷:市售;果树枝条:当年无果枝。 2、处理与方法 1) 11371对苹果树腐烂病菌孢子萌发的影响,测定采用悬滴法。设不同浓度和重复。 2)

他克莫司联合罗格列酮对TNF-α诱导的HaCaT细胞LL37及NF-kB表达的影响

目的:确定他克莫司与罗格列酮单独及联合应用对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的HaCaT细胞LI37及核因子-κB(NF-κB)表达的影响。方法:利用TNF-α诱导体外培养的HaCaT细胞处于炎性状态,在不同浓度的他克莫司与罗格列酮单独及联合作用下,采用RT-PCR法检测LI37的表达情况,采用免疫细胞化学(SABC)法检测NF-κB的表达情况。结果:(1)TNF-α诱导的HaCaT细胞中LI37及NF-κB的表达显著高于对照组(P<0.05)。(2)他克莫司、罗格列酮单独及联合应用均可显著抑制TNF-α诱导的HaCaT细胞LL37及NF-κB的表达(P<0.05);二者联合应用的作用效果均较单独用药组更强(P<0.05)。结论:他克莫司和罗格列酮联合应用能增强其对TNF-α诱导的LL37及NF-κB表达的抑制作用。

pORF5质粒蛋白拮抗LL37抗菌肽增强沙眼衣原体感染的初步研究

目的 探讨pORF5质粒蛋白能否通过抑制LL37抗菌肽增强沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）感染,并初步探讨其分子机制.方法 表达并纯化GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白经蛋白酶酶切制备不含GST标签的pORF5蛋白;pORF5蛋白和LL37单独或共孵育衣原体后再感染HeLa细胞,间接免疫荧光技术计数衣原体包涵体形成数量;荧光定量PCR检测TNF-α、LL37基因表达水平.结果 单独Ct感染组衣原体包涵体形成单位（IFU）为3.8×105/ml,LL37处理组IFU为2.0 × 105/ml,pORF5蛋白处理组IFU为3.0×105/ml,pORF5蛋白和LL37共处理组IFU为3.1×10/ml.pORF5蛋白处理组、LL37与pORF5蛋白共处理组和单独Ct感染组之间比较,差异无统计学意义（P＞0.05）,但明显高于LL37单独处理组（P＜0.05）.pORF5蛋白和LL37共同处理组TNF-α表达水平明显高于LL37单独处理组（P＜ 0.01）;pORF5蛋白处理组较Ct处理组LL37基因转录水平下降了19％.结论 pORF5质粒蛋白能拮抗LL37抗菌肽增强Ct感染,其机制可能与上调肿瘤坏死因子α、下调LL37表达相关.

内原性抗菌肽CAP18/LL37的研究进展

内原性抗菌肽CAP-18/LL37是发现的人类唯一的Cathelicidins家族的成员,是中性粒细胞特殊颗粒(亦称二级颗粒)中的主要蛋白质,其含有N-端Cathelin域及C-端抗菌活性域,而蛋白酶3是唯一在CAP18出胞后对其进行裂解的蛋白酶。经研究其有抗微生物活性、结合和抑制脂多糖活性、免疫调节、参与伤口的愈合和血管的发生等多种功能,本文就近年国外对其结构、代谢、功能等各方面研究做一综述。

抗菌肽LL37在银屑病发病机制中的研究现状

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，与自身反应性T细胞的局部活化及表皮角质形成细胞的异常增殖分化密切相关。银屑病患者皮损中含有大量免疫活性物质，包括多种细胞因子、趋化因子以及抗菌肽LL37等。正常情况下，细胞凋亡产生的少量DNA／RNA可被自身降解，并不引起炎症反应，但角质形成细胞的过度增殖活化，可在皮损局部产生大量自体DNA及RNA。LL37可以破坏机体对自身DNA／RNA的天然免疫耐受，并与之结合形成免疫复合物。该复合物运送至浆细胞样树突细胞早期内体单元中，在Toll样受体的介导下，浆细胞样树突细胞产生大量干扰素-α，而干扰素-α是银屑病中的关键性炎症因子，可以导致银屑病的发病与持续。

抗菌肽LL⁃37在骨质疏松症中的作用机制研究进展

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPS)是一种宿主防御肽,既往主要关注其抗细菌及抗病毒作用,进一步研究发现AMPS可在成骨、破骨、免疫、促进血管生成等多个途径调控骨代谢、参与骨质疏松症的发生发展。本文旨在总结AMPS在骨代谢中的调控机制,探讨其对骨质疏松症的影响为AMPS治疗骨质疏松症提供理论依据。

中老年2型糖尿病牙周炎患者龈沟液抗菌肽水平及其与牙周临床指标的相关性

目的探究牙周炎合并2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者龈沟液中抗菌肽人β防御素2(human betadefensin2,HBD2)和LL37的水平变化规律及其与牙周临床指标的相关性。方法选取于深圳市慢性病防治中心口腔科和内科就诊的中老年人(45至85岁)为研究对象,分为全身健康并牙周健康对照组22人、全身健康牙周炎组19人、T2DM牙周健康组15人、T2DM合并牙周炎组21人。采用佛罗里达牙周探针进行牙周检查,记录受试者牙周临床指标,包括探诊深度(probing depth,PD)、附着水平(attachment level,CAL)和探诊出血(probing bleeding,BOP)。采用酶联免疫吸附法检测龈沟液中抗菌肽HBD2、LL37浓度,比较组间抗菌肽HBD2、抗菌肽LL37及牙周临床指标间的差异,并进行相关性分析。结果T2DM合并牙周炎组的PD值大于全身健康牙周炎组(P<0.05);全身健康牙周炎组龈沟液中HBD2和抗菌肽LL37水平均高于全身健康并牙周健康对照组(P<0.05),全身健康牙周炎组龈沟液中HBD2水平高于T2DM合并牙周炎组(P<0.05)。全身健康牙周炎组龈沟液中抗菌肽HBD2、LL37与PD、CAL呈正相关(P<0.05),T2DM合并牙周炎组龈沟液中抗菌肽HBD2、LL37与PD、CAL相关性无统计学意义(P>0.05)。结论中老年T2DM牙周炎患者龈沟液抗菌肽HBD2、LL37水平较低,与牙周临床指标PD、CAL无显著相关性。