竹盐酿造酱油对H_2O_2诱发LLC-PK1细胞氧化损伤的保护作用

目的:研究竹盐酿造酱油乙醇提取物对H2O2诱发猪肾近曲上皮小管细胞(pig proximal tubular cell)LLC-PK1氧化损伤的保护作用。方法:以不同质量浓度(10~200μg/m L)的竹盐酿造酱油乙醇提取物预培养LLC-PK1细胞24 h后,换用含500μmol/L H2O2的DMEM细胞培养液继续培养4 h建立细胞氧化损伤模型。四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞生存率,硫代巴比妥酸比色法测定细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,比色法测定细胞内过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性和谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量。结果:经不同质量浓度竹盐酿造酱油乙醇提取物预处理24 h后,受损细胞的生存率上升,细胞内MDA生成量减少,ROS水平显著降低。同时,细胞内抗氧化酶(CAT、SOD和GSH-Px)的活性及其m RNA转录水平,GSH含量也较未经竹盐酿造酱油乙醇提取物处理的受损细胞增加。结论:竹盐酿造酱油乙醇提取物可以通过提高细胞内抗氧化酶系的活性和抗氧化物质GSH的含量而有效地对抗H2O2诱发的LLC-PK1细胞氧化损伤。

葛根素对热应激诱导的LLC-PK1细胞HSP70表达的影响

为研究不同浓度葛根素对热应激诱导的LLC-PK1细胞HSP70 mRNA和蛋白表达的影响,筛选出葛根素诱导HSP70表达的最佳浓度。选取处于对数增长期的猪肾小管上皮细胞,分为37℃对照组和42℃热应激组,热应激组细胞先在加入不同浓度（0.01～100μmol/L不等）葛根素的培养基中培养,热应激之后,提取总RNA和总蛋白,用RT-PCR和Western Blot检测HSP70 mRNA和蛋白的相对表达量。结果显示,42℃热应激和不同浓度的葛根素均能显著诱导LLC-PK1细胞的HSP70 mRNA和蛋白的表达,并且,随葛根素浓度升高,HSP70表达量增加,在各浓度组中,10μmol/L的葛根素诱导HSP70的表达最显著（P〈0.01）。上述结果证明,葛根素能够诱导热应激条件下LLC-PK1细胞HSP70的表达,并且随葛根素浓度升高,HSP70表达量增加。

庆大霉素诱导LLC-PK1细胞凋亡与p27^(Kip1)表达关系的研究

目的 观察庆大霉素对体外培养的肾小管上皮细胞凋亡的诱导作用 ;研究细胞周期调节蛋白 p2 7Kip1蛋白和mRNA表达在凋亡过程中的变化 ;并探讨细胞凋亡与p2 7Kip1之间的关系。方法 对体外培养的猪肾近端小管上皮细胞株 (LLC PK1细胞 )予以不同浓度的庆大霉素溶液分别作用 2 4～ 96h ,以MTT法测定庆大霉素对LLC PK1细胞增殖的抑制率 ,抽提细胞DNA进行琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡条带 ,流式细胞术测定细胞凋亡率和细胞增殖动力学 ,WesternBlot法检测细胞内p2 7Kip1的蛋白表达 ,RT PCR法检测细胞p2 7Kip1mRNA表达的变化。结果 庆大霉素对LLC PK1细胞增殖有抑制作用 ,具诱导LLC PK1细胞凋亡的作用 ,凋亡率呈药物浓度和作用时间依赖性 ;庆大霉素致细胞周期停滞于G1期。p2 7Kip1蛋白在细胞内的表达随着干预的庆大霉素浓度增加而逐渐上调 ,蛋白水平与凋亡率之间呈正相关 ,其mRNA表达趋势与其蛋白表达一致。结论 庆大霉素诱导的LLC PK1细胞凋亡与细胞周期蛋白p2 7Kip1表达密切相关。

人参皂苷20(s)-Rg3对llc-pk1细胞中顺铂所致肾毒性的保护作用

目的:探讨人参皂苷20(s)-Rg3对llc-pk1细胞中顺铂所致肾毒性的保护作用。方法:通过基于细胞的肾脏保护试验,研究了发酵黑参(FBG)及其活性成分人参皂苷20(S)-Rg3对猪肾(LLC-PK1)细胞中顺铂(化疗药物)诱导的损伤的保护作用。结果:由顺铂诱导的细胞活力降低,再使用FBG提取物和人参皂苷20(S)-Rg3依赖剂量后明显恢复。用FBG提取物或人参皂苷20(S)-Rg3处理后会降低顺铂诱导升高与磷酸化c-Jun N-末端激酶(JNK),p53和裂解的半胱天冬酶-3升高的蛋白。通过用FBG和人参皂苷20(S)-Rg3的共同处理,由于顺铂的诱导导致凋亡LLC-PK1细胞升高的百分比显著降低。结论:人参皂苷20(s)-Rg3可改善LLC-PK1的细胞毒性,人参皂苷20(S)-RG3可能是通过阻断JNK-P53-caspase-3信号级联反应来介导这种作用的重要组成部分。

低渗培养对LLC-PK1细胞pICln蛋白分布的影响

目的探讨低渗条件下LLC-PK1细胞pIC ln蛋白的分布变化。方法分别用等渗和50%低渗培养基对LLC-PK1细胞进行培养,用抗pIC ln血清抗体对细胞可溶性和不溶性成分的pIC ln进行W estern b lot检测,同时进行细胞的荧光抗体染色。结果W estern b lot显示等渗培养时LLC-PK1细胞可溶性成分中pIC ln免疫反应带的密度为(51±3)%;50%低渗培养时明显增多到(69±3)%,两者比较有统计学意义(P<0.01)。荧光抗体染色也显示了pIC ln在胞质中明显增多。结论pIC ln对低渗是敏感的,它可能作为胞质调节蛋白、低渗时在胞质中分布增多能促进胞内渗透性物质的运出,参与调节细胞体积而对抗低渗。

黄芩苷对热应激条件下LLC-PK1细胞HSP70表达的影响

为了探讨不同浓度黄芩苷对热应激条件下猪肾小管上皮(LLC-PK1)细胞HSP70表达的影响,筛选出黄芩苷诱导热应激条件下细胞HSP70表达的最佳浓度。将培养的LLC-PK1细胞随机分为7个组,Ⅰ组为37℃常温对照组,Ⅱ组为42℃单纯热应激组,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组和Ⅶ组分别为42℃热应激并用不同浓度黄芩苷(0.01~100μg/m L)处理组,运用实时荧光定量PCR和Western Blot检测HSP70 m RNA及蛋白的表达。结果显示,42℃单纯热应激能显著诱导LLCPK1细胞HSP70的表达;一定浓度范围内的黄芩苷(0.1~10μg/m L)处理的LLC-PK1细胞HSP70表达显著高于42℃单纯热应激;黄芩苷(0.01~100μg/m L)能显著上调热应激条件下LLC-PK1细胞HSP70的表达,且1μg/m L的黄芩苷上调效果最显著。

韩国产芝麻酱油对AAPH诱发LLC-PK1细胞氧化应激的保护作用

以芝麻酿造酱油乙醇提取物(ethanol extract sesame sauce,SSE)为研究对象,探讨其对1 mmol/L 2,2’-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(2,2’-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride,AAPH)引发的LLC-PK1猪肾近曲小管上皮细胞氧化应激损伤的保护作用。方法:LLC-PK1细胞与不同质量浓度(10~100μg/m L)的SSE预先共同培养24 h后,用含AAPH的DMEM培养液继续培养4 h建立细胞损伤模型。细胞存活率用四甲基偶氮唑蓝法检测,细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和总活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平分别以硫代巴比妥酸比色法和2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠探针法测定。细胞内过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase,GST)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase,γ-GCS)活力和谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量按试剂盒说明书以比色法测定。结果表明,SSE预处理可以提高受损细胞存活率,降低细胞内总ROS水平和MDA含量。同时,SSE还能提高受损细胞内抗氧化酶(CAT、SOD、GSH-Px)及γ-GCS活力并提高细胞内GSH含量。实时荧光定量聚合酶链式反应分析也提示SSE能上调细胞内抗氧化物酶(CAT、SOD和GSH-Px)的m RNA表达量。此外,SSE可以通过提高细胞内源性抗氧化系统能力来降低细胞内MDA和ROS水平,并由此缓解AAPH对LLC-PK1细胞所造成的氧化应激损伤。

茯砖茶对H_2O_2诱发LLC-PK1细胞损伤的保护作用

探讨茯砖茶乙醇提取物(FTE)对H2O2诱发猪肾近曲小管LLC-PK1上皮细胞氧化损伤的保护作用。以不同质量浓度(10～200μg/mL)的FTE预培养LLC-PK1细胞24 h后,换用含500μmol/L H2O2的DMEM细胞培养液继续培养4 h建立细胞氧化损伤模型。MTT法检测细胞生存率,硫代巴比妥酸比色法测定细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,比色法测定细胞内过氧化氢酶(catalase,CAT),超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-px)含量。经不同浓度FTE预处理24 h后,受损细胞的生存率上升,细胞内MDA生成量减少。同时,细胞内主要抗氧化酶(CAT、SOD和GSH-px)含量也较对照组增加,并呈剂量效应关系。结果提示,预先经FTE的保护可有效地对抗H2O2诱发的LLC-PK1细胞氧化损伤。

氧化应激介导达氟沙星诱导LLC-PK1细胞周期阻滞

目的探讨达氟沙星诱导LLC-PK1细胞氧化应激后细胞损伤的分子机制。方法不同浓度的达氟沙星处理LLCPK1细胞后,通过WST-1法检测细胞增殖抑制情况,DHE、Amplex Ultra Red法分别检测超氧阴离子自由基(O2·-)、H2O2含量,Rhodamine123法检测线粒体膜电位,流式细胞仪检测分析细胞周期及RT-PCR法检测细胞周期相关基因表达含量的变化。结果达氟沙星呈浓度依赖性的抑制LLC-PK1细胞的增殖、升高细胞内O2·-、H2O2含量、诱导细胞周期阻滞,但线粒体膜电位没有显著性下降。100μmol/L浓度达氟沙星处理LLC-PK1细胞后细胞出现G2期周期阻滞,ROS升高含量在自身抗氧化系统修复范围内,细胞并没有出现明显损伤;而浓度达到400μmol/L时细胞发生氧化应激出现可逆性的G1期细胞阻滞,此时细胞周期素抑制蛋白p53、p21、p27m RNA表达显著升高,LLC-PK1细胞对氧化应激造成的损伤进行修复。结论 400μmol/L浓度范围内的达氟沙星处理LLC-PK1细胞24h所致的氧化应激诱导细胞周期阻滞,细胞损伤在自身修复范围之内并未导致细胞凋亡。

猪丁型冠状病毒在悬浮培养猪肾细胞LLC-PK1上的增殖特性分析

旨在分析猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)在悬浮培养的猪肾细胞LLC-PK1上的增殖特性,为PDCoV灭活疫苗的规模化生产提供细胞材料。采用逐步降血清法优化LLC-PK1细胞悬浮培养工艺;利用有限稀释法筛选PDCoV适应性细胞株;利用间接免疫荧光法鉴定PDCoV对LLC-PK1细胞的感染性;分别对PDCoV接种LLC-PK1悬浮细胞的初始密度、MOI、收毒时间、TPCK胰酶浓度等参数进行优化,确定最佳悬浮培养条件。成功筛选出可高效增殖PDCoV的单克隆悬浮细胞株LLC-PK1Sa,且利用其增殖的PDCoV可特异性的感染LLC-PK1细胞;PDCoV按MOI为10^(-3)接种于密度为2×10^(6) cells·mL^(-1)的LLC-PK1Sa细胞,当TPCK胰酶终浓度达到7.5μg·mL^(-1)时,接毒后48 h收获的病毒液滴度最高。本研究首次实现了PDCoV在LLC-PK1Sa悬浮细胞中的高效增殖,并对悬浮培养条件进行了初步优化,可为PDCoV灭活疫苗的规模化生产提供理论参考。

镉通过氧化应激机制诱导LLC-PK1细胞损伤

目的探讨镉诱导猪肾近曲小管上皮细胞(LLC-PK1)毒性及氧化应激在其中的作用。方法用不同浓度的氯化镉刺激细胞9h和25μmol/L的氯化镉刺激细胞不同时间,采用Formazan分析细胞存活率反映镉对细胞的损伤程度;以还原型谷胱甘肽(GSH)为靶点,影响GSH浓度的两个试剂BSO和NAC,观察镉诱导细胞损伤中氧化应激的作用。结果随着氯化镉染毒时间延长,细胞存活率下降,同样,随着剂量的增加,细胞的存活率逐渐也下降。同时BSO加重镉诱导的细胞损伤,NAC完全抑制镉诱导的细胞损伤。结论氯化镉对LLC-PK1细胞具有明显的毒性,细胞损伤是通过氧化应激介导,且与细胞内的谷胱甘肽的水平有着密切关系。

保元排毒丸对顺铂致LLC-PK1细胞毒性的保护作用

目的:观察保元排毒丸对顺铂所致猪肾小管上皮细胞(LLC-PK1)损伤的影响及超氧化物岐化酶(SOD)和一氧化氮(NO)的变化。方法:LLC-PK1细胞分4组培养,空白血清组采用不含药血清进行培养,含药血清组以保元排毒丸含药血清进行培养,模型组以不同浓度的顺铂进行培养,模型+含药血清组是在不同浓度的顺铂基础上予以10%保元排毒丸含药血清进行培养。在培养12h和24h时以MTT法测定OD值,计算细胞存活率。培养24h时,取细胞液测定SOD和NO含量。结果:与空白血清组相比含药血清组OD值明显升高(P<0.01),模型+含药血清组细胞存活率明显高于模型组(P<0.01),模型+含药血清组细胞液NO含量明显低于模型组(P<0.01)。结论:保元排毒丸能促进LLC-PK1细胞的增殖,并具有抗氧化功能,能预防或降低顺铂引起的肾毒性。

保元排毒丸对顺铂引起的LLC-PK1细胞凋亡干预作用研究

目的:观察保元排毒丸对顺铂(DDP)所致猪肾小管上皮细胞(LLC-PK1)凋亡的影响。方法:LLC-PK1细胞分三组培养,空白血清组采用不含药血清进行培养,模型组分别以10和6μg/mL不同浓度的DDP进行培养,模型+含药血清组是在不同浓度的DDP基础上予以10%保元排毒丸含药血清进行培养。培养24h后分别以荧光显微镜、电镜、流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:与空白血清组比较,荧光显微镜下模型组凋亡细胞增多,而模型+含药血清组凋亡细胞数明显减少;电镜下模型组细胞受损明显,而模型+含药血清组细胞形态基本正常。流式细胞仪检测细胞凋亡率,空白对照组为2·45%;各DDP组明显增加,10μg/mL组和6μg/mL组分别为31·80%和30·98%,与空白对照组比较差异有统计学意义,P<0·001;各含药血清组明显减少,DDP10μg/mL+含药血清组和DDP6μg/mL+含药血清组分别为15·21%和14·27%,与相应模型组比较差异有统计学意义,P<0·001。模型组bcl-2基因及突变型p53基因的表达均明显降低,相应含药血清组的表达均有所上调。结论:保元排毒丸能减轻顺铂所致LLC-PK1细胞的凋亡,上调凋亡抑制基因bcl-2和突变型p53,可预防或降低顺铂引起的肾毒性。

热应激诱导猪肾小管上皮(LLC-PK1)细胞线粒体凋亡相关因子的时效表达

拟探讨热应激诱导LLC-PK1细胞线粒体凋亡相关因子的表达和活性情况,以及激活线粒体凋亡通路的时间。采用qRT-PCR方法和Caspase活性检测试剂盒分别检测42℃热应激处理后0,2,4,8,16 h以及37℃培养的LLC-PK1细胞中HSP72、Bcl-2、Bax、AIF和Cyt.c的基因表达以及Caspase-9和Caspase-3的活性。结果显示,42℃热应激1 h,LLC-PK1细胞Bcl-2/Bax（P〈0.05）和AIF（P〈0.01）基因表达以及Caspase-3（P〈0.01）活性从0 h开始升高（P〈0.01）,到2 h达到最高（P〈0.01）;HSP72基因表达和Caspase-9活性0 h即达到最高（P〈0.01）;Cyt.c基因表达在2 h开始极显著升高（P〈0.01）,并且此时最高,8 h以后全部因子恢复到正常水平。结果表明,42℃热应激1 h即激活LLC-PK1细胞线粒体凋亡通路,且热应激后的0~8 h线粒体凋亡通路处于活化状态,其中2 h时最为活跃。

马兜铃酸I诱导的LLC-PK1细胞凋亡及其意义

目的探讨在体外条件下马兜铃酸Ｉ（ＡＡＩ）能否诱导肾小管上皮细胞发生凋亡及发生凋亡的条件。方法应用光镜、琼脂糖凝胶电泳、ＡｎｎｅｘｉｎＶＦｌｏｕｓ凋亡检测试剂盒鉴定细胞凋亡，应用流式细胞仪测定凋亡细胞比例。结果００２ｇ／Ｌ，００４ｇ／Ｌ，００８ｇ／Ｌ的ＡＡＩ作用２４小时可明显诱导ＬＬＣＰＫ１细胞凋亡，００１ｇ／Ｌ的ＡＡＩ无此作用。随ＡＡＩ浓度的增高，凋亡细胞比例增加。结论在体外条件下一定浓度的ＡＡＩ能诱导ＬＬＣＰＫ１细胞发生凋亡，其作用与浓度有关。

肾康注射液对肾小管上皮细胞LLC-PK_1分泌层粘连蛋白的影响

目的 :探讨肾康注射液对肾小管上皮细胞LLC -PK1分泌层粘连蛋白 (LN)的影响。方法 :用细胞酶联免疫吸附 (ELISA)方法 ,以单味大黄注射液为实验对照组 ,检测肾康注射液对肾小管上皮细胞LLC -PK1分泌LN含量的影响。结果 :肾康注射液可以显著抑制肾小管上皮细胞LLC -PK1分泌LN的含量 ,并呈剂量依赖关系 ;肾康注射液作用明显优于同等含量的单味大黄注射液。结论 :肾康注射液抑制肾小管上皮细胞LLC -PK1分泌LN含量 ,是该方延缓慢性肾衰竭进展的机理之一。

镉诱导LLC-PK_1细胞凋亡对基因表达的影响

目的探讨镉诱导猪肾近曲小管上皮细胞(LLC-PK1)凋亡对bcl-2、p53(mtp53)、c-mycc、-fos与ras基因表达的影响。方法采用流式细胞仪分别测定bcl-2、p53、c-myc、c-fos与ras基因表达产物。结果不同浓度CdCl2(0,10,20,40μmol/L)作用LLC-PK1细胞,8 h后bcl-2表达逐渐下降,并呈良好的剂量-反应关系(r=-0.910,P<0.05);4,8 h p53表达均明显下降,呈剂量-反应关系(r值分别为-0.716,-0.972,P均<0.05);8 h后c-myc表达逐渐下降,呈剂量-反应关系(r=-0.694,P<0.05);8 h后c-fos表达未见剂量-反应关系;8 h后ras表达逐渐下降,呈明显的剂量-反应关系(r=-0.887,P<0.05)。结论镉诱导LLC-PK1细胞凋亡的机制可能与镉抑制bcl-2、p53、c-mycr、as基因表达有关。

低氧对LLC-PK_1细胞增殖及去分化的影响

目的：研究低氧对近端肾小管细胞株（ＬＬＣ－ＰＫ１）细胞增殖和去分化的作用。方法：ＬＬＣ－ＰＫ１细胞分别置于低氧（３％Ｏ２）和正常氧（１８％Ｏ２）孵箱中培养，用３Ｈ－胸腺嘧啶掺入法和细胞计数，观察细胞增殖情况；以钠依赖葡萄糖和氨基异丁酸（ＡＩＢ）转运为指标，观察细胞分化程度；用放射核素法测定蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）活性。结果：与正常氧培养比较，低氧培养１６ｈ，３Ｈ－胸腺嘧啶掺入显著增加；培养２４ｈ，细胞数显著增加；培养７２ｈ，细胞摄取α－甲基糖甙和ＡＩＢ显著降低。细胞低氧培养４ｈ，细胞膜与细胞质ＰＫＣ活性比率增高，随后降至原先水平；但继续培养至２４ｈ，ＰＫＣ活性再次增高，直至７２ｈ，表明ＰＫＣ呈急性和持续双相激活。ＰＫＣ抑制剂可显著抑制低氧诱导的３Ｈ－胸腺嘧啶掺入，并显著增加α－甲基糖甙和ＡＩＢ转运。结论：慢性低氧可诱导ＬＬＣ－ＰＫ１细胞的增殖和去分化。