百合花发育相关基因LLGLO1的RNAi载体构建

百合花发育相关基因的研究是开展花卉分子育种的重要基础。以麝香百合(Lilium longi-florumThumb.)未开放的花蕾为材料提取总RNA。根据LLGLO1序列的同源比对选取特异区段,设计引物扩增区段cDNA并引入酶切位点。将PCR扩增片断连接到T载体上,经酶切及PCR验证后进行测序。测序结果表明:用于RNAi的cDNA片断与LLGLO1序列完全相同。通过中间载体pSK+intron引入一段内含子间隔区,RNA干扰片断经过多次的酶切和连接过程最终连入表达载体pCAMBIA1301中形成ihpRNA结构。PCR及双酶切鉴定结果显示,构建的RNA干扰载体的ihpRNA结构完整。

麝香百合花发育基因LLGLO1在花蕾中的时空表达

为了获得百合花发育相关的B功能基因LLGLO1在调控百合花发育过程中的重要信息,以麝香百合(Lilium longiflorum)未开放的花蕾为试材,以LLGLO1基因的特异片段为探针,应用RNA原位杂交技术,对LLGLO1基因在花发育各个阶段的时空表达动态进行了研究。结果表明,LLGLO1基因在外轮花被、内轮花被、雄蕊和心皮等4轮花器官中均有表达,但表达强度随不同的发育阶段而变化。长度2.0和3.0cm的花蕾中LLGLO1基因的表达量明显高于0.5和1.0cm的花蕾,说明随着花器官的发育成熟,该基因在各轮花器官中的表达量逐渐增加。

麝香百合花蕾组织原位杂交体系的建立

本研究以麝香百合未开放的花蕾为实验材料,以百合花发育相关的B功能基因LLGLO1的特异片段为探针,研究了花蕾切离时间对RNA结构完整性的影响,探讨了蛋白酶K消化浓度及时间对材料内蛋白质消化及材料结构完整性的影响。研究结果表明:花蕾离体1.5 h内RNA仍然保存完整,花蕾离体2 h RNA开始降解,因此,花蕾取材后应在1.5 h之内完成固定。10μg/mL的蛋白酶K在37℃孵育30 min可消化百合花蕾切片中的大部分蛋白质且材料结构完整。原位杂交结果显示LLGLO1基因在四轮花器官中均有表达。