鼻咽癌组织中miR-200c、LMP1、ZEB2和E-cadherin的表达及调控作用

目的:观察鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)组织中miR-200c、潜伏期膜蛋白1(LMP1)、E盒结合锌指蛋白2(zinc finger E-box-binding protein 2,ZEB2)和E-cadherin的表达变化,并探讨其调控作用。方法:选取2021-05~2022-06于广州市花都区人民医院住院的NPC患者62例和鼻咽炎患者41例为研究对象。分别采用RT-PCR法检测两组患者组织中的miR-200c、LMP1、ZEB2和E-cadherin mRNA的表达和免疫印迹的方法检测两组组织中LMP1、ZEB2和E-cadherin蛋白表达,并对miR-200c、LMP1、ZEB2和E-cadherin mRNA的表达进行Pearson线性相关分析。结果:NPC组织中miR-200c的表达水平低于鼻咽炎组(P<0.05),LMP1和ZEB2 mRNA和蛋白的表达水平均高于鼻咽炎组(P<0.05),E-cadherin mRNA和蛋白的表达水平低于鼻咽炎组(P<0.05);NPC组织中LMP1 mRNA与miR-200c的表达呈负相关(r=-0.853,P<0.05),miR-200c与ZEB2 mRNA的表达呈负相关(r=-0.842,P<0.05),ZEB2 mRNA与E-cadherin mRNA表达呈负相关(r=-0.590,P<0.05)。结论:NPC组织中LMP1和ZEB2表达升高,而miR-200c和E-cadherin表达水平降低,有望成为NPC诊疗新靶点;LMP1可能通过诱导下调miR-200c的表达,使得ZEB2转录因子表达上调,最终抑制E-cadherin的表达,从而促进NPC的侵袭和转移。

鼻咽癌组织中EB病毒LMP1的表达与癌细胞增殖和凋亡的关系

目的：探讨EB病毒编码的LMP1在体内鼻咽癌细胞中，是否可能通过影响鼻咽癌细胞增殖和凋亡的生物学过程，而在鼻咽癌的发展演进过程中起作用。方法：采用TUNEL法原位检测癌细胞的调亡程度，用免疫组化LSAB法检测LMP1、PCNA、p53和bcl－2蛋白表达Z分析LMP1的表达与癌细胞增殖、凋亡以及与p53、bcl－2表达的相关性。结果：LMP1的表达与否，与鼻咽癌细胞增殖活性的差异无显著意义，而与癌细胞凋亡程度之间的差异有显著意义，其表达与癌细胞凋亡程度呈正相关；LPM1的表达与p53和bcl－2的表达无相关性。结论：提示LMP1在体内鼻咽癌组织中可能有促使癌细胞凋亡的生物学作用，其机制可能是通过激活细胞毒性T淋巴细胞，增强后者对癌细胞的杀伤作用。LMP1对癌细胞增殖和凋亡的作用可能并不受p53及bcl－2表达的影响。

EBV-LMP1上调Ezrin表达对鼻咽癌细胞转移潜能的影响

背景与目的:细胞骨架相关蛋白Ezrin的异常表达与肿瘤侵袭转移密切相关,既往研究已证实EB病毒潜伏膜蛋白1(Epstein-Barr virus latent membrane protein1,EBV-LMP1)可促进鼻咽癌细胞的转移能力。本研究旨在进一步探讨EBV-LMP1是否通过改变Ezrin的表达来影响鼻咽癌细胞的转移能力。方法:采用免疫细胞化学和Western blot检测两种鼻咽癌细胞株-CNE1细胞(EBV阴性)和CNE1-GL细胞(稳定转染EBV-LMP1)中LMP1和Ezrin的表达;细胞-基质粘附实验检测CNE1、CNE1-GL和经Ezrin抗体预处理的CNE1-GL细胞(AntiEzrin-CNE1-GL)对细胞外基质的粘附力;Transwell小室法检测上述3种细胞的运动和对重组基底膜侵袭能力。结果:CNE1细胞中Ezrin阴性表达,而CNE1-GL细胞中Ezrin强阳性表达。CNE1-GL细胞对细胞外基质的粘附率[(89.38±6.12)%]强于CNE1细胞[(49.42±5.37)%](P<0.001),而AntiEzrin-CNE1-GL细胞对基质的粘附率[(56.94±4.08)%]明显下降,与CNE1-GL相比,差异有统计学意义(P<0.05)。运动实验和侵袭实验均提示CNE1-GL细胞运动、侵袭能力(107±11和179±25)强于CNE1细胞(27±3和46±6),差异均有统计学意义(P<0.001),而AntiEzrin-CNE1-GL细胞的运动、侵袭能力(38±4和51±5)较CNE1-GL细胞显均显著下降(P<0.001)。结论:CNE1细胞中EBV-LMP1可通过上调Ezrin表达来促进细胞转移。

EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞系中通过TRAF2活化NF-kB

目的：为了探讨ＥＢ病毒（ＥＢＶ）中ＬＭＰ１的致瘤机制，对鼻咽癌ＬＭＰ１激活重要的核转录因子ＮＦ－_ＫＢ的机制进行了研究。方法：①以ＬＭＰ１阴性的鼻咽癌细胞系ＨＮＥ２及表达载体（ｐＳＧ５）的鼻咽癌细胞系ＨＮＥ２－ｐＳＧＳ为对照，采用免疫共沉淀－Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ方法在稳定表达ＬＭＰ１的鼻咽癌细胞系ＨＮＥ２－ＬＭＰ１中证实ＬＭＰ１与ＴＲＡＦ２是否直接结合形成免疫共沉淀复合物；②在ＨＮＥ２－ＬＭＰ１细胞系导入ＴＲＡＦ２表达质粒或不同剂量ＴＲＡＦ２显性负性突变体（ＴＲＡＦ２Ａ６－ ８６）表达质粒，以 ＮＦ－ｋＢ报道基因方法确定 ＬＭＰ1是否通过 ＴＲＡＦ2活化 ＮＦ－ｋＢ ；③将ＬＭＰ１（１－２３１）（ＣＴＡＲ２缺失区）或ＬＭＰ１△１８７－３５１（ＣＴＡＲＩ缺失区）及不同剂量ＴＲＡＦ２Ａ６－８６瞬时导入ＨＮＥ２中以证实ＬＭＰ１ ＣＴＡＲ１或ＣＴＡＲ２是否介导了这种效应；④以转染或未转染ＴＲＡＦ２６－８６的ＨＮＥ２－ＬＭＰ１细胞系为材料，应用免疫共沉淀－Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ方法，确定ＴＲＡＦ２△６－８６是否竞争性抑制ＴＲＡＦ２与ＬＭＰ１结合。结果：①在ＨＮＥ２－ＬＭＰ１中ＬＭＰ１与ＴＲＡＦ２形成复合物?

EB病毒LMP1对人鼻咽癌细胞转移能力的影响

背景与目的:EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)在鼻咽癌的浸润和转移过程中起重要的作用。本实验目的在于研究EB病毒LMP1对人鼻咽癌细胞转移能力的影响和探讨其中的相关机制。方法:应用免疫细胞化学RT-PCR法和Western blot检测LMP1、E-cadherin和intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)在人高分化鼻咽癌细胞系CNE1和转染了LMP1基因的CNE1-GL细胞中的表达。应用细胞-细胞粘附实验、细胞-基质粘附实验、划痕实验和细胞运动实验观察LMP1对鼻咽癌细胞粘附和运动能力的影响。结果:免疫细胞化学结果显示:LMP1在CNE1和CNE1-GL细胞中的阳性率分别为0和(96.60±3.03)%(P<0.01);E-cadherin蛋白的阳性率分别为(37.47±1.50)%和(19.53±1.92)%(P<0.01);ICAM-1蛋白的阳性率分别为(5.27±1.45)%和(93.33±4.23)%(P<0.01)。RT-PCR和Westernblot结果表明,与CNE1细胞相比较,CNE1-GL细胞中E-cadherin的mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.01),而ICAM-1的mRNA和蛋白表达则明显升高(P<0.01)。肿瘤细胞同质粘附实验显示,CNE1-GL细胞的同质粘附能力较CNE1细胞弱(P<0.05)。肿瘤细胞-基质粘附实验得出CNE1-GL细胞的异质粘附能力(A值=0.60±0.03)较CNE1细胞(A值=0.46±0.01)强(P<0.01)。肿瘤细胞运动实验显示,穿过PVPF膜的CNE1-GL细胞数多于CNE1细胞(119.3±6.0 vs 46.3±7.0,P<0.05)。结论:LMP1通过抑制E-cadherin表达、促进ICAM-1表达从而抑制肿瘤细胞的同质粘附能力、增强其异质粘附能力和运动能力来参与鼻咽癌的侵袭和转移。

EB病毒LMP1对鼻咽癌中瘤细胞分化的影响

目的 探讨EB病毒LMP1对早期鼻咽癌中瘤细胞分化的影响。方法 收集 31例早期鼻咽非角化性癌活检组织。采用DAKO公司的PNA探针和PNA原位杂交试剂盒检测EB病毒早期RNAs (EBERs)。应用免疫组化法检测LMP1,α catenin ,β catenin ,γ catenin以及高、低分子量细胞角蛋白。结果 31例癌组织中均有相当数量的瘤细胞呈EBERs阳性 ,其中19例表达LMP1( 6 1.2 9% )。LMP1阳性组γ catenin的表达百分率 ( 5 3 .2 5± 34.12 % )明显低于LMP1阴性组 ( 80 .42±15 .77% ,P <0 .0 1)。γ catenin的表达与低分子量细胞角蛋白的表达间呈正相关 (r=0 .44 0 ,P <0 .0 5 )。α catenin ,β catenin和γ catenin的表达相互间呈两两正相关。结论 鼻咽癌中瘤细胞的LMP1能下调γ catenin的表达 ,从而抑制瘤细胞的分化。

EB病毒LMP1促鼻咽癌细胞生长与CD23、bcl-2表达和凋亡的关系

目的 :探讨EB病毒LMP1表达促鼻咽癌细胞系生长作用与CD2 3、bcl 2表达和细胞凋亡的关系。方法 :用免疫组化LSAB法检测LMP1、CD2 3和bcl 2蛋白的表达 ;用MTT法测定鼻咽癌细胞系的生长能力 ;用DNA电泳法、流式细胞法和TUNEL法检测癌细胞凋亡 ;用CD2 3单抗阻断和MTT法观察CD2 3单抗对鼻咽癌细胞系生长的影响。结果 :表达LMP1的鼻咽癌细胞系 (L CNE1)的生长能力明显增强 ,并有CD2 3蛋白表达 ,而非表达LMP1的鼻咽癌细胞系 (V CNE1和CNE1)的CD2 3表达阴性 ;3种鼻咽癌细胞系均无凋亡发生 ,而都仅有 2 %～ 3 %的细胞表达bcl 2蛋白 ;CD2 3单抗能明显地抑制L CNE1细胞系的生长 ,但对V CNE1和CNE1细胞系的生长无明显影响。结论 :提示LMP1促鼻咽癌细胞系生长可能是通过上调CD2 3所致 ,而与bcl 2的表达和细胞凋亡无关。

EBV-LMP1促CNE2细胞迁移的作用机制

目的:探讨EBV-LMP1对鼻咽癌细胞CNE2迁移表型的影响及作用机制。方法:用RV-LNSX,RV-LMP1和RV-LMP1TRADD逆转录病毒分别感染CNE2细胞,G418筛选后,观察和检测转基因细胞的形态学特点,在基质中的运动迁移能力以及E-钙黏蛋白(E-Cadherin)表达的变化;用pLNSX,pLNSX-LMP1和pLNSX-LMP1TRADD质粒分别与E-Cadherin报告基因共转染293细胞,检测LMP1对E-Cadherin启动子活性的影响。结果:与CNE2和CNE2-LNSX细胞相比,CNE2-LMP1在培养过程中由扁平、鹅卵状上皮细胞形态逐渐演变为细胞间接触消失的长梭状纤维细胞形态,相对迁移明显增大(n=3,P<0.05),且E-Cadherin表达明显下调或缺失;随着共转染野生型LMP1(pLNSX-LMP1)剂量的增加(0.2,0.6,1.0μg),对E-Cadherin启动子转录活化的抑制率增加,呈明显浓度依赖性;LMP1TRADD不改变CNE2细胞形态学及迁移表型,对E-Cadherin启动子的转录活性及蛋白表达亦无明显影响。结论:抑制E-Cadherin启动子活化可能是EBV-LMP1下调E-Cadherin蛋白表达、促CNE2细胞迁移的机制之一,位于LMP1羧基端的TRADD可能是其促迁移的主要活性部位。

EB病毒LMP-1上调鼻咽癌细胞系AP-1的活性

为了探讨 EB病毒潜伏膜蛋白 1 ( LMP- 1 )通过信号传导途径介导的致瘤分子机制 ,由此首先构建了 AP- 1报告基因 ,用佛波酯诱导确定了其报道 AP- 1的功能 ;通过建立荧光素酶双报道系统 ,研究了 LMP- 1表达对 AP- 1和 NFκB活性的影响 .研究发现 :在 LMP- 1阴性鼻咽癌 ( NPC)细胞系 ,导入 LMP- 1表达质粒后 ,AP- 1和 NFκB的活性均升高 4～ 5倍 ;而在 LMP- 1阳性 NPC细胞系中 ,当导入 LMP- 1反义表达质粒 ,AP- 1和 NFκB的活性则受抑制 ,活性下调 3～ 4倍 .结果表明 ,LMP- 1能上调 NPC细胞系 AP- 1的活性 ,同时再次证实了 LMP- 1能活化 NFκB.

鼻咽癌中EB病毒LMP1基因N端XhoⅠ酶切位点的丢失

背景与目的;众所周知,EB病毒LMP1基因在鼻咽癌变过程起着一定的作用。本研究通过检测广东地区鼻咽癌组织EB病毒LMP1基因N-末端区Xho Ⅰ酶切位点的丢失,探讨LMP1基因变异在鼻咽癌发生发展中的作用。方法:收集中山大学肿瘤防治中心鼻咽癌患者鼻咽新鲜活检标本63例。收集EB病毒健康携带者外周血单个核细胞(PBMCs)10例作为对照。采用QIAamp DNA Mini Kit和QIAampDNA Blood Mini Kit分别抽取组织和外周血单个核细胞的DNA,应用巢式PCR扩增EB病毒LMP1基因的N-末端区,并用Xho Ⅰ对扩增产物进行酶切。采用四色荧光 末端终止法对扩增产物进行序列分析。结果:10例健康携带者外周血单个核细胞的EB病毒LMP1基因N-末端区均未见Xho Ⅰ酶切位点的丢失。63例鼻咽癌组织中有50例(79.37％)出现Xho Ⅰ酶切位点的丢失(Xho Ⅰ-loss),还有4例(6.34％)为Xho Ⅰ酶切位点部分丢失,只有9例(14.29％)未见Xho Ⅰ酶切位点的丢失(wt-Xho Ⅰ)。除了Xho Ⅰ酶切位点的丢失(nt:169423～169428;GAGCTC→GA T CTC)外,还发现四个错义点突变。结论:本研究所检测的广东地区EB病毒健康携带者外周血单个核细胞所携带的EB病毒LMP1基因为wt-Xho Ⅰ,而在鼻咽癌组织中主要为Xho-Ⅰ-loss。因此,我们认为EB病毒LMP1基因N-末端区Xho Ⅰ酶切位点的丢失和其?

EBV-LMP1 cDNA的克隆测序与原核表达质粒构建

目的 克隆EBV LMP1cDNA ,构建EBV LMP1基因的原核表达重组质粒。方法 通过RT PCR技术从B95 8细胞中扩增EBV LMP1cDNA ,克隆至pGEM Teasy载体上并测序 ;利用引物上的BamHⅠ与HindⅢ酶切位点将LMP1基因插入载体pET 32a,转化JM10 9菌。提取质粒 ,限制性内切酶消化 ,琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果 扩增的LMP1cDNA长度为 115 8bp ,测序结果与已知序列吻合 ,重组原核表达质粒经酶切鉴定表明获得正确重组子。结论 成功克隆了EBV LMP1cDNA ,并构建了pET 32a LMP1原核表达载体 。

人突变型p53和EB病毒LMP1转基因小鼠的建立

目的:建立含突变型p53和EB病毒LMP1基因的双转基因小鼠模型,为研究突变型p53和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌前病变中的交互作用提供有力的工具.方法:通过分子克隆技术构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53mt;采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核中,然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管;取其产3wk龄子代鼠进行PCR初选,再通过Southern杂交进一步确证;利用HE染色法观察4mo龄转基因小鼠不同组织病理变化.结果:将转基因载体进行了707枚小鼠受精卵的显微注射,然后植入30只假孕母鼠的输卵管中,其中26只母鼠怀孕,移植成功率为86.67%;共出生子代鼠179只;PCR检测显示179只子代小鼠中有9只整合了p53mt和LMP1基因,转基因阳性小鼠比例为5.03%(9/179),Southern杂交结果进一步证实了9只基因组整合了外源基因的首建者小鼠;随机抽取其中的1只转基因阳性小鼠鼻腔黏膜、鼻咽、食管表现炎症,鼻咽黏膜上皮灶性增生.结论:成功建立整合人突变型p53和LMP1的转基因小鼠,且表现鼻咽黏膜上皮灶性增生,可为鼻咽癌前病变机制的研究提供手段.

EBV-LMP1C端RNA的体外转录合成及其靶脱氧核酶的初步筛选

目的探讨用体外转录方法制备EBV-LMP1C端RNA并用该RNA对其靶脱氧核酶进行初步筛选。方法用巢式PCR方法从绒猴淋巴细胞系B95-8细胞中扩增EBV-LMP1exonc,重组入pGEM-11zf载体,并用T7RNA聚合酶对其进行体外转录制备EBV-LMP1C端RNA。根据该RNA的一、二级结构设计合成3种靶向10～23脱氧核酶,据体外剪切效率筛选高效特异的靶向脱氧核酶。结果成功地构建含EBV-LMP1exonc基因的重组质粒,用体外转录方法用1μg质粒转录出40.25μg高纯度的EBV-LMP1C端RNA,有1种脱氧核酶DZ1对该RNA体外剪切效率达89%。结论用T7RNA聚合酶体外转录方法成功制备了高纯度的EBV-LMP1C端RNA,经体外剪切筛选出高效特异的1种脱氧核酶,为进一步研究奠定了基础。

高通量组织微阵列研究Wnt5a和LMP1在鼻咽癌癌变中的作用

目的:研究Wnt5a和EB病毒潜伏膜蛋白1(Epstein-Barr virus latent membrane protein 1,LMP1)在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)癌变过程中作用的分子机制,评估其是否可作为NPC相关的分子标志物。方法:利用前期制备的NPC组织微阵列芯片,免疫组织化学检测Wnt5a和LMP1在NPC癌变过程不同组织中的蛋白表达,分析Wnt5a异常激活和LMP1蛋白过表达在NPC发生发展中的作用及其与NPC临床病理特征的关系,评估其是否可作为鉴别鼻咽良恶性病变的分子标志物。结果:Wnt5a和LMP1蛋白在NPC中的阳性表达率显著高于异型增生鼻咽上皮、增生鼻咽上皮和正常鼻咽上皮(P<0.05,P<0.01,P<0.01);异型增生鼻咽上皮中的Wnt5a和LMP1蛋白阳性表达率也显著高于增生鼻咽上皮和正常鼻咽上皮(P<0.05,P<0.01)。Wnt5a蛋白和LMP1蛋白在临床Ⅲ和Ⅳ期NPC组织中的阳性表达率显著高于临床Ⅰ和Ⅱ期(P<0.01,P<0.05),有淋巴结转移的NPC组织中Wnt5a蛋白阳性表达率也显著高于无淋巴结转移NPC组织(P<0.01),非角化性NPC组织LMP1蛋白阳性表达显著高于未分化癌和角化性癌(P<0.05,P<0.05);NPC组织中Wnt5a与LMP1蛋白的阳性表达存在显著正相关性(r=0.354,P<0.001)。LMP1和Wnt5a蛋白联合表达检测有助于鼻咽良恶性病变的鉴别。结论:NPC组织中Wnt5a和LMP1的表达存在显著正相关,两者可能共同或相继促进鼻咽上皮细胞的恶性转化和NPC的发生发展;联合应用LMP1和Wnt5a可作为NPC鉴别诊断的较好分子标志物。

EB病毒LMP-1在鼻咽癌细胞中通过JNK介导AP-1活化

EB病毒潜伏膜蛋白 1 (latentmembraneprotein 1 ,LMP 1 )活化激活蛋白 1 (activatorprotein 1 ,AP 1 )信号传导途径与其致瘤作用密切相关 .为了探讨LMP 1活化AP 1信号传导的分子机制 ,在可诱导调控LMP 1表达的鼻咽癌细胞系L7中 ,首先通过荧光酶双报道系统确定了LMP 1表达能激活AP 1 ;在此基础上 ,用c JunPathDetect系统确定LMP 1表达活化AP 1是通过c Jun的磷酸化 (活化 )介导 .虽然LMP 1不能上调c Jun上游主要调节激酶c JunN端激酶 (c JunN terminalkinase ,JNK)的蛋白表达 ,但能显著促进JNK的磷酸化 (活化 ) ;在L7细胞中导入JNK相互作用蛋白 (JNK interactingprotein ,JIP)基因 ,抑制JNK的核移位能显著抑制LMP 1诱导的AP 1活化 ,同时对NFкВ活化也有部分抑制作用 .结果表明 ,EB病毒LMP 1在鼻咽癌细胞中通过JNK介导AP

LMP1羧基端活化区3对鼻咽癌干细胞SP18迁移与侵袭的影响

为了观察潜伏性膜蛋白1(LMP1)羧基端活性区3(CTAR3)对鼻咽癌干细胞SP18迁移与侵袭的影响,本研究通过建立稳定表达LMP1及CTAR3突变型LMP1(LMP1△252-351)的SP18细胞系(即SP18-LMP1和SP18-LMP1△252-351),观察LMP1-CTAR3缺失突变后对SP18细胞增殖、迁移与侵袭的影响.采用基因芯片分析SP18-LMP1和SP18-LMP1△252-351间的差异表达基因,并验证基因的表达,用生物信息学分析差异表达基因间的相互关系.结果显示:a.SP-LMP1△252-351细胞生长速度较SP-LMP1细胞明显变缓,克隆形成和迁移与侵袭能力降低(n=3,P<0.05);b.鉴定出LMP1羧基端CTAR3影响SP18细胞迁移与侵袭的18个基因(其中表达上调基因13个,下调基因5个),经荧光定量PCR验证与基因芯片检测结果基本一致.c.13个差异基因间相互联系,网络节点联系最多的基因是FN1、MMP14、THBS1、ITGA2、IL1B和IL6基因.结果提示,LMP1羧基端CTAR3可能通过调节FN1、MMP14、THBS1、ITGA2、IL1B和IL6基因的表达,发挥其促鼻咽癌干细胞SP18细胞迁移与侵袭的功能.

人鼻咽癌细胞裸鼠体内演进中bcl-2、p53及c-erbB-2表达与EB病毒LMP1的关系

目的 研究 EB病毒 L MP1在人高分化鼻咽癌细胞裸鼠体内演进中的作用及与 bcl- 2、p5 3及 c- erb B- 2蛋白表达的关系。方法 将表达 EB病毒 L MP1的人高分化鼻咽癌细胞及对照阴性细胞移植于裸鼠体内 ,然后将移植瘤细胞再移入裸鼠建立第二代移植瘤 ,如此传至第三代 ,分别观察移植瘤的成瘤和生长的变化 ,以免疫组化和图像分析技术检测移植瘤细胞 bcl- 2、p5 3及 c- erb B- 2蛋白表达。结果 表达 L MP1的鼻咽癌细胞原代移植成瘤率达 75 .0 %,比对照组显著增高 (P<0 .0 1)。平均潜伏期及体内倍增时间分别为 2 9.6± 7.7天和 2 .81± 0 .13天 ,比对照组明显缩短 (P<0 .0 1)。表达 L MP1的鼻咽癌细胞 (C1L)各代移植瘤的 bcl- 2蛋白表达阳性率显著低于对照组对应的各代细胞的表达 (P<0 .0 1) ;bcl- 2蛋白表达阳性率有显著下降趋势 ,对照组细胞 bcl- 2蛋白表达则呈峰值变化 ;各细胞系体内移植瘤细胞的 p5 3及 c- erb B- 2蛋白表达的变化趋势较为相似 ,即各细胞系不同代间 p5 3表达的阳性率有显著下降趋势 ,c- erb B- 2蛋白表达阳性率有显著上升趋势。表达 L MP1的鼻咽癌各代移植瘤细胞的 p5 3及 c- erb B- 2蛋白表达阳性率显著高于对照组对应的各代 (P<0 .0 1)。结论 L MP1使鼻咽癌细胞的生长能力增强 。

LMP-1基因慢病毒载体构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞的表达

目的:构建人LMP-1重组慢病毒载体,体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,检测LMP-1基因在大鼠骨髓间充质干细胞的表达。方法:利用PCR法从cDNA文库中钓取LMP-1基因,将其与经AgeⅠ酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU-EGFP相连接,转化感受态大肠杆菌,筛选出阳性克隆pGC-FU-LMP-1-EGFP,基因测序对其鉴定。经293T细胞包装后,收集富含病毒颗粒LV-LMP-1-EGFP的细胞上清,浓缩并标定滴度,RT-PCR检测并鉴定。以最佳MOI值体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜观察转染是否成功,流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR和Western blot检测转染细胞LMP-1基因的表达。结果:①基因测序及RT-PCR检测证实携带人LMP-1基因的慢病毒载体构建成功,包装后获得滴度为2×108TU/ml的LV-LMP-1-EGFP。②以MOI=100转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下可见大量绿色荧光蛋白表达,转染效率可达93.5%,经RT-PCR与Western blot检测,被转染细胞内有LMP-1基因表达。结论:成功构建携带人LMP-1基因的慢病毒载体,可高效转染大鼠骨髓间充质干细胞,被转染细胞可高效表达LMP-1基因。

LMP-1 mRNA反义寡核苷酸抑制大鼠成骨细胞的分化

为深入探讨LIM矿化蛋白 1(LMP 1)在成骨细胞分化中的作用 ,体外培养大鼠成骨细胞 ,在培养基中加入LMP 1反义寡核苷酸 (LMP 1antisense终浓度为 0 8mol L) ,以阻断大鼠成骨细胞中LMP 1mRNA的表达。对照组加nonsense(终浓度为 0 8mol L)。测定细胞的碱性磷酸酶 (ALP)活性、培养基中骨钙素 (OC)的含量 ,免疫组化分析Ⅰ型胶原蛋白的表达 ,Northernblotting检测Ⅰ型胶原mRNA的表达。结果显示 :LMP 1mRNA被LMP 1antisense阻断后 ,ALP活性降低、OC分泌减少、Ⅰ型胶原蛋白和mRNA的表达下降。上述结果表明 :LMP 1mRNA被LMP 1反义寡核苷酸阻断后 ,成骨细胞分化受到明显的抑制 ,提示LMP 1是成骨细胞分化必不可少的正调节因子。

EB病毒LMP1及其CTAR1、CTAR2导入人HNE2鼻咽癌细胞的研究

用电穿孔转染法 ,建立稳定表达野生型LMP1及其不同突变体的鼻咽癌细胞系 ,并以这些细胞系为材料 ,用MTT法检测增殖期活细胞 ,观察LMP1及其不同的结构域对鼻咽癌细胞生长的影响。结果得到了LMP1及其三种突变体、空白载体表达的鼻咽癌细胞系 :HNE2 -LMP1(野生型 )、HNE2 -LMP1△ 185 - 35 1(CTAR1缺失型 )、HNE2 -LMP1(1- 2 31) (CTAR2缺失型 )、HNE2 -LMP1(1- 185 ) (羧基端胞浆区缺失型 )、HNE2 -pSG5 (空载体型 )。进一步证实HNE2 -LMP1、HNE2 -LMP1(1- 2 31)、HNE2 -LMP1△ 185 - 35 1平均吸光度 (A )比值高于对照组HNE2 -pSG5及HNE2 (P <0 0 1)。这提示 :EB病毒LMP1及其LMP1(1- 2 31)和LMP1△ 185 - 35 1在体外明显促进HNE2细胞增殖。结果表明EB病毒LMP1可能在鼻咽癌中发挥着重要的作用。