EB病毒潜伏期膜蛋白2A重组腺病毒的制备及表达

目的 :构建EB病毒潜伏期膜蛋白 2A重组腺病毒 ,研究EB病毒相关肿瘤治疗性疫苗。方法 :利用RT PCR扩增出EB病毒B95 8株潜伏期膜蛋白 2A(LMP2A)全部编码蛋白的基因 ,并克隆至pGEM T载体中。并将LMP2AcDNA插入E1、E3区替代的腺病毒载体pAX1CW ,选择正确的克隆pAX1CW LMP2A与Ad5DNA 末端肽复合体共转染 2 93细胞 ,通过同源重组获得复制缺陷型的重组腺病毒。提取重组腺病毒转染的 2 93细胞DNA ,通过酶切初步鉴定。选择阳性克隆感染CV1细胞 ,通过流式细胞仪和激光共聚集显微镜分析LMP2A蛋白表达情况。结果 :挑选同源重组 17个克隆中有 9个为阳性克隆 ,扩增到的病毒滴度为 2 3× 10 8pfu/ml。用MOI =10 0的重组腺病毒感染CV1细胞 ,48h后在激光共聚焦显微镜下可见LMP2A蛋白表达于CV1细胞膜上 ,经流式细胞仪检测LMP2A蛋白表达阳性细胞数为 94 4 %。结论 :重组腺病毒能有效地介导LMP2A基因的表达 ,为进一步研究该基因功能及其工程疫苗打下了基础。