小麦Glu-D3和Glu-B3位点LMW-GS基因特异引物设计与PCR扩增

用CTAB法提取小麦基因组DNA ,根据GenBank中公布的已知LMW GS基因序列 ,设计并合成染色体位点特异PCR引物 1～ 7;利用特殊小麦材料———六倍体普通小麦阿勃二体、1A、1B和 1D缺体 ,四倍体小麦及二倍体的一粒小麦和节节麦的基因组DNA为模板 ,在优化的PCR体系下进行特异性扩增和引物验证。结果表明 :引物 3和引物 4为小麦谷蛋白Glu D3位点LMW GS基因特异PCR引物 ,用其进行扩增时 ,循环反应条件为 :94℃变性 1min ,6 2℃退火 1min ,72℃延伸 2min。扩增产物大小约 1.6 0kb ,包括了启动子和完整编码区。引物 5和 7为小麦谷蛋白Glu B3位点LMW GS基因特异PCR引物 ,用其进行扩增时 ,循环条件为 :94℃变性 1min ,6 4℃退火 1min ,72℃延伸 2min。扩增产物大小约 1.4 5kb左右 ,包括了启动子和完整编码区。此外 ,用引物 3和 4通过PCR技术克隆到小偃 6号小麦Glu D3位点LMW GS基因(登录号为AY2 6 336 9) ;该基因编码的LMW GS含 9个Cys残基。这是首次发现含 9个Cys残基的LMW GS基因。它可能是小偃 6号加工品质优良的主要原因之一。

西藏半野生小麦LMW-GS基因的克隆及序列分析

根据小麦低分子量谷蛋白基因序列保守区设计的引物W12 2 7/ 12 2 8对特异种质资源 西藏半野生小麦(Triticumaestivumssp .tibetanumShao)AS90 8总DNA进行PCR扩增 ,得到约 95 0bp的DNA片段 ,分离纯化后连接到pBluescriptSK(+/ )T载体上 ,转化、筛选后选取 3种不同类型的阳性克隆进行测序 ,获得 3个不同的基因序列 ,Ti bet1、Tibet2和Tibet3。其中 ,Tibet1(GenBank登录号 :AY2 994 5 7)、Tibet2 (GenBank登录号 :AY2 994 5 8)的编码区长度分别为 10 4 1bp和 90 6bp ,可编码 32 6和 2 81个氨基酸残基的成熟蛋白。Tibet3(GenBank登录号 :AY2 994 5 9)由于编码区内有 2个提前终止密码子而为不可编码成熟蛋白的假基因。序列比较显示AY2 994 5 7、AY2 994 5 8和AY2 994 5 9分别与GenBank中Glu D3、Glu A3和Glu A3位点编码的LMW GS基因AY2 14 4 5 0、AJ2 930 99和AB0 6 2 871有较高的一致性 ,且序列结构非常相似 ,因而推测它们与之有类似的品质功能 。

小麦HMW-GS和LMW-GS对新疆拉面及蛋白质品质的影响

为了探讨小麦HMW-GS和LMW-GS对新疆拉面及蛋白质品质的影响,以195份新疆小麦品种(系)为供试材料,测定其蛋白质品质性状,评价其新疆拉面加工品质,筛选出HMW-GS、LMW-GS存在单亚基等位变异的材料,进行成对数据的t测验。结果表明,就不同位点等位变异对新疆拉面加工品质的贡献大小来讲,Glu-A1位点上,1≥2*>Null;Glu-B1位点上,17+18≥7+9≥7+8≥20≥6+8;Glu-D1位点上,5+10>2≥2+12;Glu-A3位点上,gluA3c≥gluA3a>gluA3d;Glu-B3位点上,gluB3b≥gluB3a>gluB3d>gluB3c≥gluB3g>gluB3j。不同亚基造成新疆拉面加工品质改善的蛋白质机理不同,其中1、2*、7+9、17+18、5+10、gluA3a、gluB3a、gluB3b、gluB3d和gluB3g显著提高了蛋白质的质量;7+8亚基同时显著提高了蛋白质的数量和质量。对于单个亚基而言,Null、7+8、2、gluB3d和gluB3g对籽粒和面粉蛋白质含量,Null、1、2、gluA3d和gluB3d对湿面筋含量,1、2*、7+8、7+9、5+10、gluB3a、gluB3b、gluB3d和gluB3g对Zeleny沉淀值,1、2*、7+8、17+18、5+10、gluB3a和gluB3b对峰值时间,1、7+8、gluA3a、gluB3c、gluB3b、gluB3d和gluB3g对峰值高度,1、2*、7+8、5+10、gluB3a、gluB3b、gluB3d和gluB3g对峰值宽度,1、2*、7+8、17+18、5+10、gluB3a、gluB3b、gluB3d和gluB3g对8min宽度,1、2*、7+8、7+9、17+18、5+10、gluB3a、gluB3b和gluB3g对8min面积均有显著提高或增加的作用。

人工合成小麦RSP的LMW-GS基因克隆

RSP是用抗穗发芽的节节麦与圆锥小麦合成的人工六倍体小麦Triticumturgidum-Aegilopstauschii),其抗穗发芽特性在维持小麦面粉加工品质方面有着潜在的重要价值。为了了解其低分子量谷蛋白这一对小麦加工品质有直接重要影响的蛋白组分情况,本研究采用PCR法从合成小麦RSP中克隆得到3个低分子量谷蛋白亚基(LMW-GSs)基因,命名为LMWRSP-1、LMWRSP-2和LMWRSP-3。基因序列GenBank登录号分别为AY676681、AY676682和AY676683。其中,LMWRSP-1和LMWRSP3的编码区长度分别为825bp和915bp,可分别编码274和304个氨基酸。LMWRSP-2由于在编码区内有1个提前终止密码子,推测为不编码成熟蛋白的假基因。与已知LMW-GS基因进行比较发现,LMWRSP-1与Glu-A3位点基因的相似性最高,LMWRSP-3与Glu-D3位点的基因相似性最高。

小麦LMW-GS基因PCR初步研究

用CTAB法提取小麦材料基因组DNA,根据基因库中公布的已知LMW-GS基因序列,设计并合成染色体位点特异的PCR引物1～7;探索出优化的PCR反应体系,即20μL反应体积中,Mg2+浓度为2.5mmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,模板DNA30～60ng,每种引物50ng,Taq酶0.5U。利用特殊小麦材料——六倍体普通小麦(染色体组为AABBDD)、四倍体小麦(AABB)及二倍体一粒小麦(AA)和节节麦(DD)等的基因组DNA为模版,在优化的PCR反应体系下进行特异性扩增和引物验证。结果表明,引物3和引物4为小麦谷蛋白Glu-D3位点LMW-GS基因的特异引物,用其进行扩增时,循环反应条件为94℃变性1min,62℃退火1min,72℃延伸2min;扩增产物大小约为1.63kb,包括启动子和整个编码区。引物5和7为小麦谷蛋白Glu-B3位点LMW-GS基因的特异引物,用其进行扩增时,循环反应条件为94℃变性1min,64℃退火1min,72℃延伸2min;扩增产物大小约为1.45kb,包括启动子和整个编码区。

滨麦低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)基因的分离与序列分析

采用PCR方法,从滨麦(Leymus mollis)基因组中分离出8条LMW-GS基因序列。核苷酸序列分析表明,序列GQ169791在起始密码子上游包含318 bp的启动子序列,该序列包含-300元件、GCN4 motif、种子贮藏蛋白盒等基因特异表达的顺式或反式作用调控元件。推导的氨基酸序列分析表明,8条序列的编码区依次有信号肽,N-末端区,中部重复区和C-末端Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区等典型LMW-GS多肽一级结构特征;序列HQ416909、HQ416914和HQ416915具有单一完整的开放阅读框(ORF);序列GQ169791、HQ416910、HQ416911、HQ416912和HQ416913在中部重复区和C-末端区出现了4个或5个提前终止密码子,推断其为假基因。8条序列都含有8个或9个半胱氨酸残基(C),N-末端区起始氨基酸序列为METSRIPG-或METTRIPG-,推断其为LMW-m型LMW-GS基因。系统进化分析表明,8条序列与华山新麦草(Psathyrostachys huashanica)LMW-GS基因(HM475146,GQ223386)和野大麦(Hordeum brevisubulatum)的B-hordein基因(AY695368)具有相对较近的同源关系。该研究为挖掘利用滨麦LMW-GS的基因提供了理论依据,对小麦品质改良具有一定参考价值。

硅橡胶中的LMW含量及其对憎水迁移性的影响

硅橡胶绝缘材料良好的憎水性，使其在电力系统中得到了广泛的应用。现已证明，ＬＭＷ（ｌｏｗｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ轻重量分子）是使硅橡胶绝缘在污秽状态下仍保持憎水性的主要原因。因此，一定量的ＬＭＷ是硅橡胶绝缘在表面电晕或污秽条件下，仍能保持具有一定憎水性的关键因素。利用ＣＨ２Ｃｌ２提取ＬＭＷ技术［１］，探讨了ＲＴＶ（ｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｖｕｌｃａｎｉｚｉｎｇ室温硫化）和ＨＴＶ（ｈｉｇｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｖｕｌｃａｎｉｚｉｎｇ高温硫化）硅橡胶中ＬＭＷ的含量，并就ＬＭＷ含量对憎水迁移性的影响进行了初步探讨。

LMW-GS16基因表达载体的构建

采用PCR方法对来自大麦的LMW-GS16基因进行修饰,在基因5′及3′端分别加入构建表达载体所需的BamHⅠ和SacⅠ限制酶切位点,并将其连接在相应酶切的质粒pBI121上,构建成LMW-GS植物表达载体pBI121-16。重组质粒转化到E.coliDH5α和农杆菌LBA4404中,通过Kanamycin筛选阳性克隆,用PCR方法进行鉴定。对照组转化率为零,转化组阳性克隆特异地扩增出900 bp片段,与目标基因DNA大小一致,转化率为1.0×106/μg DNA。

啤酒泡沫中HMW和LMW组分蛋白质的研究

研究啤酒泡沫中HMW和LMW蛋白质组分。主要利用80%硫酸铵沉淀啤酒泡沫中大部分的蛋白质,再利用SephadexG-75层析柱可以将啤酒泡沫蛋白质分为HMW和LMW蛋白组分;通过SDS-PAGE凝胶电泳可以明显看出HMW和LMW的蛋白分子量的范围;再利用HPLC分析HMW和LMW蛋白组分中的氨基酸。

陕南鄂西丘陵麦区小麦HMW-GS组成和LMW-GS等位基因变异

采用SDS-PAGE凝胶电泳和STS标记方法分别对陕南鄂西丘陵麦区小麦品种(系)中的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)组成和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)Glu-A3与Glu-B3位点的等位基因进行了检测,并通过STS特异性标记对SDS-PAGE凝胶电泳检测的HMW-GS部分结果进行了验证。结果表明:(1)陕南麦区64份小麦材料中共检测到9种HMW-GS类型,其中Glu-A1位点含有Null、1共2种等位变异,频率分别为53.12%和46.88%;Glu-B1位点有7+8、7+9、14+15和17+18共4个等位变异,频率分别为26.56%、48.44%、21.88%和3.13%;Glu-D1位点有2+12、5+10和4+12共3种等位变异,频率为71.88%、15.63%和12.49%;而且17种不同亚基组合中以"1,7+9,2+12"与"Null,7+9,2+12"为主。(2)64份小麦材料中检测到11种LMW-GS类型,其中Glu-A3位点存在Glu-A3a、Glu-A3c和Glu-A3d共3种等位变异,分布频率为10.94%、62.50%和26.56%;GluB3位点有Glu-B3a、Glu-B3b、Glu-B3d、Glu-B3e、Glu-B3f、Glu-B3g、Glu-B3i和Glu-B3j共8种等位变异,分布频率分别为6.25%、4.69%、29.69%、1.56%、3.13%、18.75%、4.69%、31.25%。(3)2个特异性STS标记对SDSPAGE凝胶电泳检测到的HMW-GS部分组成结果验证表明,STS标记可以有效克服SDS-PAGE方法检测小麦HMW-GS中的7与7*、8与8*以及2与2*亚基的误读问题,为小麦品质育种与食品加工提供理论支持。

西农538 LMW-GS基因的克隆、原核表达及功能鉴定

为了探索普通小麦品种西农538的LMW-GS对面粉加工品质的影响,根据NCBI中已公布的LMW-GS基因序列,设计了一对特异性引物,从西农538基因组DNA中克隆出LMW-GS基因后,对其进行原核表达及掺粉试验。序列分析表明,克隆得到的LMW-GS基因序列(GenBank登录号为KX452081)有单一完整的开放阅读框,编码区长915bp,无内含子。同源性比对及进化树分析发现,该基因属于Glu-D3、Type V(Group 10)、m型、C组LMW-GS基因。SDS-PAGE和Western blot分析表明,该基因原核表达成功。微量掺粉试验表明,诱导表达的蛋白对小麦面粉加工品质有负效应。

小麦低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)的遗传及其与品质的关系

对小麦低分子量谷蛋白亚基 (L MW- GS)的遗传及其与品质的关系加以综述。小麦低分子量谷蛋白亚基可分为 B组 L MW- GS、C组 L MW- GS和 D组 L MW- GS。编码位点分别为 Glu- 3位点、Gli- 1位点、Gli- 2位点和 Glu- 2位点。硬粒小麦中 D组 L MW- GS由 Gli- 3位点编码 ,Glu- D4位点和 Glu- D5位点分别编码 ,分子量分别为 30 k D和 33k D亚基。Glu- B2和 Glu- B4编码一些中迁移率 B组 L MW- GS。普通小麦中 Glu- A3位点上有 6个等位基因 ,Glu- B3位点上有 9个等位基因 ,Glu- D3位点上有 5个等位基因。L MW- GS对品质具有重要作用 ,对品质贡献与 HMW- GS极为相似。通过低分子量谷蛋白亚基的变异分析可得到 Glu- 3各等位基因位点与品质指标的相关性。Gli- A1和 Glu- A3位点发现重组率为 1.70± 0 .90 %。Gli- B1和 Glu- B3位点之间的重组率为 2 %。Glu- D3和 Gli- D1之间未发现明显重组。

TLR3在poly(I:C)-LMW预处理后缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元的表达意义

目的观察TRL3激动剂poly(I:C)-LMW预处理对原代皮质神经元Toll样受体3(TLR3)表达的影响,探讨TLR3在缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元损伤中的作用。方法取体外培养7d的大鼠原代皮质神经元细胞,对细胞分别予以正常条件下培养(空白对照组);缺糖缺氧2h,复糖复氧24h(OGD组);TRL3激动剂预处理12h(激动剂组);TRL3激动剂预处理12h后缺糖缺氧2h,复糖复氧24h(激动剂+OGD组)。免疫荧光法观察各组细胞生长状态,分别以Western blot法、RT-PCR法测定TLR3蛋白及TLR3mRNA的表达情况。结果 与空白对照组相比,激动剂及缺氧复氧处理方法均诱导原代皮质神经元TLR3、TLR3mRNA表达增强(P<0.05);激动剂预处理后,与OGD组相比,激动剂+OGD组神经元细胞状态较好,数目较多(P<0.05)。结论 TLR3参与缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元的损伤过程,激动剂可减轻神经元缺糖缺氧后损伤。

HMW-GS和LMW-GS组成对小麦加工品质的影响

高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)是决定小麦加工品质的重要因素。以小麦品种PH82-2(亚基组成1,14+15,2+12和Glu-A3d,Glu-B3d,Glu-D3c)和内乡188(亚基组成1,7+9,5+10和Glu-A3a,Glu-B3j,Glu-D3b)的242份F3和F4株系(试验I)和91份产量比较试验材料(试验Ⅱ)研究了贮藏蛋白组成对小麦加工品质的影响。结果表明,HMW-GS和LMW-GS等位变异对籽粒蛋白质含量的影响不大,但对加工品质均有极显著影响(P<0.01)。就位点的效应而言,Glu-D1位点对加工品质的效应较大,而Glu-D3位点的效应较小。就单个亚基而言,在Glu-B1位点,14+15<7+9;在Glu-D3位点,Glu-D3c>Glu-D3b。1B/1R易位系的部分品质性状,如峰值时间、曲线下降斜度和峰积分好于非1B/1R易位系。

HMW-GS和LMW-GS组成及1BL/1RS易位对春小麦品质性状的影响

分析了2 2 1份春小麦品种(系)的HMW GS、LMW GS组成和1BL 1RS易位状况,并用其中10 4份品种(系)研究了HMW GS和LMW GS等位变异及1BL 1RS易位对品质性状的影响。结果表明,1、7+9、5 +10、GluA3a和GluB3j分布较广,频率分别为5 7 .5 %、4 5 . 2 %、6 3 .8%、2 9. 0 %和4 2 . 5 %。1BL- 1RS易位系相当普遍,西北春麦区和东北春麦区频率分别为4 4 . 3%和34 2 %。HMW- GS和LMW -GS等位变异对SDS沉降值、和面时间与耐揉性的影响达1%显著水平,对籽粒蛋白质含量与不溶性谷蛋白含量的影响达5 %显著水平。按位点贡献大小,Glu- D1>Glu- B3>Glu -B1>Glu- A1>Glu -A3;不同亚基对品质性状的效应存在显著差异,主要表现在反映面筋强度的品质参数上。亚基1、2 、5 +10、Glu -A3d、Glu- B3f明显优于相应位点的其他亚基。1BL -1RS易位对和面时间有极显著的负向效应。

CIMMYT人工合成小麦改良品系的HMW-GS和LMW-GS组成及其对面筋品质的影响

为了给中国春小麦面筋品质性状改良提供参考依据,对来自CI MMYT的167份人工合成小麦与普通小麦的杂交后代进行了HMW-GS和LMW-GS鉴定,并测定了蛋白质含量、湿面筋含量、Zeleny沉淀值和揉面仪参数等品质性状。结果表明,亚基2*、1、7+9、5+10、Glu-A3d、Glu-B3j和Glu-B3b的分布较广,频率分别为49.1%、39.5%、58.7%、73.7%、39.5%、44.3%和32.9%。HMW-GS和LMW-GS组成对湿面筋含量的影响较小,对Zeleny沉淀值、和面时间、峰值高度、峰值宽度和8 min高度的影响皆达1%显著水平。各位点对面筋品质的贡献大小为Glu-B3>Glu-D1>Glu-B1>Glu-A1>Glu-A3;就单个亚基的贡献而言,Glu-A1位点,1>2*>Null;Glu-B1位点,7+8=17+18>7+9;Glu-D1位点,5+10>1.5+10>2+12;Glu-A3位点,Glu-A3b>Glu-A3d>Glu-A3a>Glu-A3e>Glu-A3c;Glu-B3位点,Glu-B3d>Glu-B3b>Glu-B3j。Glu-B3j(即1B/1R易位)广泛存在于人工合成小麦与普通小麦的杂交后代中,对面筋强度和耐揉性有不利影响,建议在品质育种中尽量避免选择含有该亚基的易位材料。

小麦Glu-B3位点LMW-GS基因的克隆及序列分析

以小麦特殊遗传材料———六倍体普通小麦阿勃二体、1A缺体、1B缺体和1D缺体,四倍体硬粒小麦墨西粒卡以及二倍体节节麦的总基因组DNA为模板,对D Ovidio等曾报道的硬粒小麦Glu-B3位点LMW-GS基因特异引物对P1(5-′tcctgagaagtgcatgacatg-3′)和P2(5-′gtaggcaccaactccggtgc-3′)进行了PCR扩增验证.结果表明,该引物对同样能特异扩增普通小麦Glu-B3位点LMW-GS基因.利用这对引物通过AS-PCR方法克隆得到优良小麦品种小偃6号1B染色体1个LMW-GS基因片段.该基因全长为1 089 bp,包含了完整的编码区和其上游318 bp的胚乳特异表达启动子区.该基因被命名为XY-Glu-B3-LMW2(GenBank登录号为DQ630442).XY-Glu-B3-LMW2的推测蛋白含256个氨基酸(包括N-端20个氨基酸的信号肽),其成熟蛋白有8个保守的Cys残基,均分布在C-末端区.XY-Glu-B3-LMW2是从小偃6号克隆到的第2个LMW-GS基因.

HMW-HDPE与LMW-HDPE的共混改性

选用一种高分子量高密度聚乙烯（ＨＭＷ－ＨＤＰＥ）和一种低分子量高密度聚乙烯（ＬＭＷ－ＨＤＰＥ），对它们的共混行为和共混物的热性能、流动性能和力学性能进行了研究。结果表明，在研究的共混比范围内，由ＤＳＣ发现双组分体系可能存在共晶相。ＨＭＷ－ＨＤＰＥ＼ＬＭＷ－ＨＤＰＥ共混体系的熔体指数基本符合Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ粘度加和方程：ＭＩ＝ＭＩｘ１１ＭＩｘ２２。在ＬＭＷ－ＨＤＰＥ质量百分含量为２０％时，共混体系的拉伸强度和断裂伸长率达到最大。随着ＬＭＷ－ＨＤＰＥ质量百分含量增加，共混体系的拉伸强度几乎直线上升。

LMW-PTP在子宫颈鳞癌中的表达及其临床意义

目的探讨低分子量酪氨酸磷酸酶（LMW—PTP）在子宫颈鳞癌中的表达及其临床意义。方法采用RT—PCR及免疫组化法分析HaCaT、C33A、SiHa和CaSki细胞系中LMW，PTP的表达情况。免疫组织化学法检测正常宫颈患者19例，宫颈上皮内瘤变（CIN）I期患者18例、CINⅡ～Ⅲ患者46例和宫颈鳞癌患者76例的组织切片中LMW—PTP的表达。结果LMW—PTPmRNA及蛋白在C33A、SiHa及CaSki宫颈癌细胞系中表达明显高于人永生化正常表皮细胞系HaCaT；临床组织样本中，正常宫颈上皮LMW—PTP几乎不表达，在正常宫颈上皮到CIN继而发展成宫颈癌的进展过程中LMW—PTP的表达逐渐升高，差异有统计学意义（P〈0．05）；低分化宫颈癌组织中LMW—PTP表达高于中分化组织（P=0．025），中分化宫颈癌组织中LMW—PTP的表达高于高分化组织（P=0．045）；宫颈癌组织中LMW—PTP蛋白的表达与组织学分级程度和是否有淋巴结转移密切相关（P〈0．05）。结论LMW—PTP在宫颈癌的进展过程中起重要作用，且与组织分化程度和是否有淋巴转移密切相关，提示LMW—PTP的表达有助于判断宫颈癌患者的预后。

普通小麦编码LMW-1、LMW-2基因的克隆及其与品质关系的研究

对12个普通小麦品种的LMW-GS进行SDS-PAGE分析表明,含有LMW-2亚基的品种的加工品质性状明显优于含有LMW-1亚基的品种。利用硬粒小麦中克隆LMW-1和LMW-2的特异引物,在"泰山201"和"PH82-2-2"两个普通小麦品种中分别克隆了一个编码LMW-1和LMW-2的基因,分别命名为PL1和PL2。通过其编码氨基酸序列分析表明,PL1属于LMW-m型,PL2属于LMW-s型。这两个基因编码的氨基酸序列的主要区别,一是PL1的氨基酸开始序列为METRCIPGL,PL2则直接以SHIPGL开始。二是PL1的氨基酸序列比PL2的有一段16个氨基酸的缺失。对PL1和PL2编码的氨基酸序列与硬粒小麦中已知的LMW-1和LMW-2序列进行了比较,PL1和PL2在与品质相关的重复区分别有三段和两段缺失。这些差异可能是影响其加工品质的重要因素。