miR-451对胶质瘤LN229细胞YWHAE表达的影响

目的观察micro RNA-451(miR-451)对胶质瘤LN229细胞YWHAE表达的影响,旨在验证YWHAE基因为miR-451的直接作用靶点。方法将细胞分为miR-451转染组、无义序列组、对照组,分别加入5 pmol miR-451mimics、无义序列、PBS与5μL Lipofectamine 2000混匀20 min,继续培养48 h。将细胞分6组,A组只转染突变型pEZX-MT01-YWHAE-3'-UTR质粒,B组共转染突变型pEZX-MT01-YWHAE-3'-UTR质粒与无义序列,C组共转染突变型pEZX-MT01-YWHAE-3'-UTR质粒与miR-451 mimics,D组只转染野生型pEZX-MT01-YWHAE-3'-UTR,E组共转染野生型pEZX-MT01-YWHAE-3'-UTR与无义序列,F组共转染野生型pEZX-MT01-YWHAE-3'-UTR与miR-451mimics,均与5μL Lipofectamine 2000混匀20 min,继续培养48 h。实时定量PCR法检测细胞miR-451、YWHAE基因表达,Western blot法检测YWHAE蛋白表达。结果对照组、无义序列组、miR-451转染组LN229细胞miR-451基因相对表达量分别为1、1.045、98.534。A～F组荧光素酶相对活性分别为5.042±0.177、5.588±0.684、4.980±0.268、5.265±0.692、5.370±0.443、3.272±0.351,F组与其他各组两两比较,P均<0.01。miR-451转染组细胞YWHAE蛋白相对表达量为0.283±0.081,较对照组(1.612±0.113)、无义序列组(1.833±0.195)明显降低(P均<0.01)。对照组、无义序列组、miR-451转染组LN229细胞YWHAE基因相对表达量分别为1、0.941、0.618。结论miR-451可以明显抑制YWHAE基因的表达,YWHAE是miR-451的直接作用靶点。

Cyclopamine对LN229细胞Nurr1基因表达的影响

目的探讨环巴胺(Cyclopamine)对恶性胶质瘤细胞株LN229帕金森相关基因Nurr1表达的影响。方法在脂多糖(LPS)刺激LN229细胞的条件下,运用实时定量PCR检测SHH通路基因PTCH、Gli1及Nurr1基因mRNA含量,Western Blotting检测LPS对LN229细胞Nurr1蛋白表达的影响。进一步在Cyclopamine阻断Sonic Hedgehog(SHH)信号通路的条件下,实时定量PCR及Western Blotting检测Nurr1的mRNA含量及其蛋白的表达及下游炎症因子IL-1βmRNA的含量。结果 LPS刺激下LN229细胞SHH通路相关基因mRNA,及Nurr1 mRNA升高,Western Blot结果进一步证明LPS可以促进Nurr1蛋白表达。Cyclopamine阻断组与对照组比较,在转录水平和翻译水平明显促进了Nurr1基因表达升高,及下游炎症因子IL-1βmRNA的含量。结论 Cyclopamine对LN229细胞Nurr1表达的影响可能与帕金森发病过程中胶质细胞的活化有关。

siRNA沉默钙蛋白酶1对人脑胶质瘤细胞LN229增殖及侵袭的影响

目的 探讨siRNA沉默钙蛋白酶1(CAPN1)对人脑胶质瘤细胞LN229增殖及侵袭的影响。方法 取人脑胶质瘤细胞LN229于37℃水浴中解冻后制备单细胞悬液,接种于细胞培养板中,融合度至90%左右,将siRNA系列、CAPN1 siRNA序列分别转染细胞,分为实验组(CAPN1 siRNA)与siRNA组,以未转染的细胞作为对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定LN229细胞中CAPN1 mRNA表达;采用MTT法测定LN229细胞增殖情况;采用Transwell小室测定LN229细胞侵袭及迁移情况;采用Western blot测定LN229细胞Bax、Bcl-2和CAPN1蛋白表达。结果 与对照组和siRNA组比较,实验组CAPN1 mRNA表达明显降低(P<0.05);与对照组和siRNA组比较,实验组LN229细胞增殖率明显降低(P<0.05);与对照组和siRNA组比较,实验组LN229细胞侵袭率明显降低(P<0.05);与对照组和siRNA组比较,实验组LN229细胞迁移数目明显降低(P<0.05);与对照组和siRNA组比较,实验组LN229细胞Bax蛋白表达灰度值明显升高,而Bcl-2和CAPN1蛋白表达灰度值明显降低(P<0.05)。而对照组和siRNA组CAPN1 mRNA表达、LN229细胞增殖率、LN229细胞侵袭率、LN229细胞迁移数目、Bax、Bcl-2和CAPN1蛋白表达灰度值比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 siRNA沉默CAPN1可抑制人脑胶质瘤细胞LN229增殖,抑制脑胶质瘤细胞侵袭和迁移,上调Bax表达及下调Bcl-2和CAPN1蛋白表达。

miR-9对人脑胶质瘤LN229细胞增殖的影响

目的探讨miR-9对人脑胶质瘤LN229细胞增殖的影响及可能机制。方法对数生长期人脑胶质瘤LN229细胞,随机分为miR-9抑制剂组(转染30 mg/L miR-9小干扰RNA质粒5μL)、空白对照组(转染空载质粒)、乳酸脱氢酶A(labeling recombinant lactate dehydrogenase A,LDHA)激动剂组(转染30 mg/L miR-9小干扰RNA质粒5μL及4 mg/L LDHA激动剂5μL)。转染后培养48 h,3组采用CCK-8法检测细胞增殖率;实时荧光定量PCR法检测miR-9 mRNA、LDHA mRNA相对表达量;氧化酶法测定葡萄糖消耗量;比色测定法测定乳糖产量。结果转染后培养48 h,miR-9抑制剂组、空白对照组、LDHA激动剂组细胞增殖率吸光度值(0.60±0.01、0.90±0.02、1.15±0.05)依次增高(P<0.05);miR-9 mRNA相对表达量在miR-9抑制剂组(0.52±0.01)、LDHA激动剂组(0.53±0.01)低于空白对照组(1.67±0.01)(P<0.05),miR-9抑制剂组与LDHA激动剂组比较差异无统计学意义(P>0.05);miR-9抑制剂组、空白对照组、LDHA激动剂组LDHA mRNA相对表达量(0.64±0.01、0.87±0.01、2.77±0.01)、葡萄糖消耗量[(0.02±0.01)、(0.36±0.01)、(0.77±0.01)nmol/L]、乳糖产量[(43.02±4.01)、(73.02±3.11)、(1562.00±5.44)nmol/L]均依次增高(P<0.05)。结论miR-9通过促进LDHA表达,增强肿瘤细胞有氧糖酵解,促进人脑胶质瘤LN229细胞增殖。

RNAi干扰脑胶质瘤CEP55表达对胶质瘤细胞LN229功能影响的相关性研究

目的探讨中心体相关蛋白55(CEP55)在胶质瘤组织及正常脑组织中的表达差异,以及通过RNAi技术敲低CEP55表达对胶质瘤细胞系LN229功能的影响。方法收集南京医科大学附属脑科医院25例胶质瘤手术标本及10例正常脑组织标本,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及Western blot检测35例样本中CEP55的表达水平。通过siRNA敲低LN229细胞系中CEP55的表达后,采用细胞计数、划痕及Transwell实验检测其对细胞增殖、迁移及侵袭功能的影响。结果 CEP55在脑胶质瘤组织中的表达量明显高于正常脑组织。干扰CEP55的表达后,胶质瘤细胞LN229的功能明显降低。结论 CEP55在胶质瘤中高表达,并参与影响了胶质瘤细胞系LN229的增殖、迁移、侵袭功能。CEP55今后可能成为胶质瘤治疗的新靶点。

NUSAP1在脑胶质瘤中的表达以及对胶质瘤细胞LN229功能的影响

目的探讨核仁纺锤体相关蛋白1(NUSAP1)在脑胶质瘤样本的高表达,以及沉默NUSAP1对胶质瘤细胞系LN229细胞功能的影响。方法收集南京医科大学附属脑科医院30例胶质瘤手术标本以及10例癫痫病灶手术样本,采用荧光实时定量(qRT-PCR)和Western blot技术检测40例样本中NUSAP1的表达情况,用lentivirus和siRNA干扰LN229细胞系中NUSAP1表达后,采用CCK-8法、流式细胞仪法检测其对细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响。结果 NUSAP1在胶质瘤组表达量明显高于癫痫组(对照)。NUSAP1表达被干扰后。脑胶质细胞LN229功能降低。结论 NUSAP1在脑胶质瘤中高表达,干扰其在LN229细胞株表达后,LN229增殖能力下降,细胞G2/M期停滞。提示NUSAP1可能成为一个新的胶质瘤治疗靶点。

紫外线灭活仙台病毒诱导人胶质瘤细胞系LN229凋亡作用(英文)

目的探讨紫外线灭活仙台病毒致人胶质瘤LN229细胞凋亡作用及其机制。方法用不同剂量灭活病毒感染LN229细胞,24h后,MTT法检测灭活病毒对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;分光光度法检测caspase活性;Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达水平。结果 MTT检测显示灭活仙台病毒能够剂量依赖性抑制LN229细胞增殖;流式细胞仪检测显示灭活病毒组细胞凋亡率呈剂量依赖性升高;caspase活性测定显示灭活病毒组细胞中caspase-3,-8和-9蛋白活性呈剂量依赖性增加;Western blotting结果显示,随着灭活病毒滴度增加,细胞中Bax、细胞色素c、Fas、FasL表达水平升高、而Bcl-2、caspase-8前体、caspase-9前体和caspase-3前体蛋白表达下降。结论灭活仙台病毒能够诱导LN229细胞剂量依赖性凋亡,其机制与线粒体途径和死亡受体途径相关。

海星皂苷CN-3激活NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路诱导胶质瘤细胞焦亡的作用

目的 研究海星皂苷面包海星3(Culcita novaeguineae-3,CN-3)诱导胶质瘤U251和LN229细胞焦亡的作用。方法 将胶质瘤U251和LN229细胞分别设置为空白对照组及CN-3低、高剂量组(3μM、6μM)。(1)细胞增殖测定(cell counting kit-8,CCK-8)法检测面包海星3(CN-3)抑制胶质瘤U251和LN229细胞增殖的给药剂量,分析CN-3对胶质瘤细胞的抑制率。(2)通过透射电镜比较空白对照组及CN-3低剂量组(3μM),观察CN-3诱导胶质瘤细胞膜形态学改变。(3)流式细胞术检测各组胶质瘤细胞焦亡细胞(Annexin V+/PI+表示焦亡细胞)比例、早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-表示早期凋亡细胞)比例。(4)蛋白免疫印迹法(Western blot, WB)检测各组中CN-3诱导胶质瘤U251与LN229细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)、剪切型胱天蛋白酶-1(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Cleaved Caspase-1)、剪切型gasdermin D蛋白N端(Cleaved N-terminal-gasdermin D, Cleaved N-terminal-GSDMD)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的表达。结果 CN-3呈剂量依赖性抑制U251和LN229细胞增殖;给药后胶质瘤细胞形态改变,局部出现气泡状凸起,细胞膜失去完整性,出现多个孔隙;流式检测表明CN-3可诱导胶质瘤细胞焦亡;与空白对照组相比,CN-3上调胶质瘤U251和LN229细胞内NLRP3、Cleaved Caspase-1、Cleaved N-terminal-GSDMD、IL-1β的表达。结论 CN-3通过激活NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路诱导胶质瘤U251和LN229细胞焦亡。

野鸢尾黄素对人脑胶质瘤细胞LN229增殖、迁移和侵袭的影响

目的观察野鸢尾黄素对人脑胶质瘤LN229细胞的增殖、迁移和侵袭能力,以及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的影响。方法将细胞分为3组,分别为空白对照组和低、高剂量实验组。空白对照组不加任何药物;低、高剂量实验组分别加入40和80μmol·L-1野鸢尾黄素。用免疫荧光实验检测细胞增殖能力,用Tranwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭能力,用蛋白质印迹法检测MMP-2蛋白的表达水平。结果干预48 h后,空白对照组和低、高剂量实验组的细胞增殖率分别为(38.07±2.53)%,(23.90±1.10)%和(12.00±2.65)%,迁移细胞数量分别为(683.33±110.15),(322.00±72.19)和(132.33±18.23)个,侵袭细胞数量分别为(715.33±109.70),(300.00±60.67)和(135.00±30.64)个,MMP-2蛋白相对表达量分别为0.95±0.05,0.77±0.06和0.27±0.06。低、高剂量实验组的上述指标与空白对照组相比,差异均有统计学意义(P <0.05或P <0.01或P <0.001)。结论野鸢尾黄素可能通过抑制MMP-2的表达,从而抑制LN229细胞的增殖、迁移及侵袭。

索拉菲尼对人神经胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探究索拉菲尼对人脑神经胶质瘤LN229细胞增殖和凋亡的影响,为临床应用提供一定的理论基础。方法体外培养LN229细胞,用CCK8法检测LN229细胞增殖、TUNEL法检测LN229细胞凋亡,Western blot技术检测Cyclin D1、caspase-3、p-ERK1/2、ERK1/2表达。结果索拉菲尼可以明显降低人脑神经胶质瘤LN229细胞活力,降低Cyclin D1和pro-caspase-3表达水平,提高TUNEL阳性率,抑制ERK1/2磷酸化。结论索拉菲尼抑制LN229细胞增殖可能与调节MAPK信号通路相关。

抑制eEF-2激酶对人脑胶质瘤细胞增殖作用的影响

目的研究抑制eEF-2激酶对人脑胶质瘤LN229细胞增殖作用的影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测抑制eEF-2激酶后LN229细胞的增殖能力,台盼蓝染色法检测细胞的存活能力,相差显微镜观察细胞形态学的变化,流式细胞仪分析细胞周期的分布,Western blot方法检测细胞phospho-eEF2和Cleaved Caspase-3、PARP蛋白表达水平的变化。结果抑制eEF-2激酶对人脑胶质瘤LN229细胞的增殖有显著抑制作用(P<0.05或0.01),呈现时间和剂量依赖性趋势;作用24 h后,随着给药浓度的增加,LN229细胞的活力逐渐降低(P<0.05或0.01),且细胞形态也逐渐发生明显改变;NH125(0.5μmol/L)作用24 h后,LN229在S期阻滞,且出现小凋亡峰,phospho-eEF2(Thr56)的表达明显下降,Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP的表达显著增加(P<0.05)。结论抑制eEF-2激酶后,人脑胶质瘤LN229的细胞增殖作用明显被抑制,细胞活力降低,该作用可能与其诱导的细胞周期阻滞以及其诱导的Caspase-3、PARP激活相关细胞凋亡途径有关。