长链非编码RNA RP1-90L14.1对前列腺癌LNCaP细胞生物学行为的影响及其机制研究

目的:研究长链非编码RNA(lncRNA) RP1-90L14.1对前列腺癌LNCaP细胞增殖、迁移、侵袭的作用以及对GRIN2A、BACE2基因表达的影响。方法:采用RT-PCR检测前列腺癌LNCaP、LNCaP-AI细胞中RP1-90L14.1的表达水平;在LNCaP细胞中瞬时转染RP1-90L14.1过表达质粒和载体质粒,即转染RP1-90L14.1实验组(LNCaP-RP1-90L14.1组)和转染阴性对照组(LNCaP-NC组);采用普通培养液和活性炭吸附无酚红培养液培养两组细胞;CCK-8法、Transwell法检测两组细胞增殖、迁移、侵袭能力;RT-PCR和Western印迹检测两组细胞中N-甲基-D-天氡氨酸离子型谷氨酸受体2A(GRIN2A)、β位点淀粉样前体蛋白裂解酶2 (BACE2) mRNA和蛋白表达含量变化。结果:RP1-90L14.1在LNCaP-AI中的表达量显著高于LNCaP细胞(8.49±0.43 vs 2.53±0.95,P<0.05)。转染RP1-90L14.1后,LNCaP-RP1-90L14.1组RP1-90L14.1表达量显著高于LNCaP-NC组(0.71±0.22 vs 0.02±0.01,P<0.05);在普通培养液和活性炭吸附无酚红培养液中,培养72 h时,LNCaP-RP1-90L14.1组细胞活性分别高出LNCaP-NC组51.95%(1.22±0.08 vs 0.08±0.05,P<0.05)和50.69%(0.79±0.02 vs 0.53±0.05,P<0.05);培养96 h时,LNCaP-RP1-90L14.1组分别高出LNCaP-NC组51.72%(1.72±0.07 vs 1.13±0.05,P<0.05)和60.23%(1.18±0.05 vs 0.73±0.08,P<0.05)。转染RP1-90L14.1后,在普通培养液和活性炭吸附无酚红培养液中,细胞迁移能力LNCaP-RP1-90L14.1组均显著高于LNCaP-NC组[(682.0±42.7)个vs(422.0±37.1)个,(419.0±42.9)个vs(251.0±25.9)个,P<0.05];细胞侵袭能力LNCaP-RP1-90L14.1组也均显著高于LNCaP-NC组[(507.0±22.2)个vs(274.0±19.6)个,(352.0±14.1)个vs(216.0±14.3)个,P<0.05]。LNCaP-RP1-90L14.1组与LNCaP-NC组相比,GRIN2A mRNA和蛋白表达量(5.13±0.89、2.09±0.54,5.88±0.29、2.03±0.22),BACE2 mRNA和蛋白表达量(5.82±0.50、2.53±0.30,4.89±0.19、3.37±0.13)均有统计学差异(P<0.05)。结论:lncRNA RP1-90L14.1可能在调控前列腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭行为中起重要作用;RP1-90L14.1能促进GRIN2A、BACE2的表达;RP1-90L14.1与GRIN2A、BACE2可能存在内源性竞争关系。

双氢睾酮和氟他胺对前列腺癌LNCaP细胞内钙离子的影响

目的:观察双氢睾酮(DHT)和氟他胺(FLU)作用于雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCa P内Ca^(2+)的变化,探讨DHT和FLU引起LNCa P细胞内Ca^(2+)变化的作用机制。方法:获得雄激素依赖性(LNCa P)细胞株,进行细胞培养,获得稳定生长及传代的细胞株。不同浓度的雄激素受体激动剂DHT及雄激素受体拮抗剂FLU作用于培养的LNCa P细胞株,不同时间点取干预措施下的LNCa P细胞,通过荧光染料负载,经流式细胞术检测并比较不同时间点、不同浓度药物作用下LNCa P细胞Ca^(2+)的变化和差异。结果:DHT作用于LNCa P细胞后,在每个剂量组中Ca^(2+)荧光强度差异有统计学意义(P<0.05),不同时间点变化差异有统计学意义(P<0.05)。FLU干预LNCa P后,各个剂量组的Ca^(2+)荧光强度随着时间的变化差异有统计学意义(P<0.05)。结论:DHT降低LNCa P细胞内Ca^(2+)含量不明显,说明对LNCa P细胞内的信号转导及凋亡影响不大;而FLU可明显提高LNCa P细胞内Ca^(2+)的浓度,导致钙超载,促进细胞的凋亡。

垂体肿瘤转化基因1在雄激素非依赖性前列腺癌发生过程中的表达变化

目的:探讨垂体肿瘤转化基因1(PTTG1)在前列腺癌由激素依赖性转化为激素非依赖性过程中的表达变化。方法:通过在去雄激素培养条件下长期培养雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCa P,建立并验证雄激素非依赖性亚系LNCa P-AI细胞模型,用Western印迹、RT-PCR方法每2周检测在去雄激素培养过程中PTTG1的表达改变。结果:经过3个月培养,成功建立雄激素非依赖性亚系LNCa P-AI细胞模型;在LNCa P细胞中,随着去雄激素培养时间延长,PTTG1的表达水平逐渐升高,基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9表达有同步升高趋势。结论:PTTG1表达在雄激素非依赖性前列腺癌发生过程中逐渐增强,可能是晚期前列腺癌基因治疗的靶标之一。

冬凌草甲素通过TPX2诱导前列腺癌细胞凋亡与周期阻滞的研究

目的 研究冬凌草甲素对前列腺癌细胞凋亡和周期的影响及机制。方法 用0 mg/L、15 mg/L、30 mg/L、60 mg/L、120 mg/L冬凌草甲素处理前列腺癌LNCa P细胞,CCK-8法检测细胞增殖,q RT-PCR和Western blot检测细胞中Xklp2靶蛋白(TPX2)表达变化。前列腺癌LNCa P细胞分成对照组(NC)、Oridonin、TPX2 si RNA、TPX2 si RNA+Oridonin共4组。NC、Oridonin为转染阴性对照慢病毒载体的LNCa P细胞,TPX2 si RNA、TPX2 si RNA+Oridonin为转染TPX2 si RNA重组慢病毒载体的LNCa P细胞,Oridonin、TPX2 si RNA+Oridonin细胞用含有70 mg/L冬凌草甲素细胞培养液培养。在LNCa P细胞中转染TPX2 si RNA慢病毒载体,q RT-PCR和Western blot检测干扰效果。用冬凌草甲素处理下调TPX2的LNCa P细胞,CCK-8法检测细胞增殖变化,PI单染法检测细胞周期分布变化,膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)双染法检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中细胞周期蛋白(cyclin B)、P21、活化的Caspase-3(C-Caspase-3)蛋白水平。结果 冬凌草甲素处理后的LNCa P细胞增殖能力降低,细胞中TPX2 m RNA和蛋白表达水平降低。下调TPX2、冬凌草甲素和下调TPX2联合冬凌草甲素处理均可以降低LNCa P细胞增殖能力,提高细胞G2/M期比率,提高细胞凋亡率,促进细胞中cyclin B、P21、C-Caspase-3蛋白表达,并且下调TPX2联合冬凌草甲素对细胞增殖抑制、细胞周期阻滞、凋亡促进和cyclin B、P21、C-Caspase-3蛋白表达促进作用增强。结论 冬凌草甲素可以通过下调TPX2表达诱导前列腺癌细胞凋亡并阻滞细胞周期。

Notch信号报告系统在前列腺肿瘤细胞系中的建立

目的在前列腺肿瘤细胞系LNCa P中建立Notch信号报告系统。方法采用In-Fusion酶系统将巨细胞病毒(CMV)启动子和Notch蛋白胞内结构域(ICD)细胞核内DNA结合蛋白CSL的8拷贝串联DNA序列克隆入p LVX-ac GFP-N1慢病毒载体,构建Notch信号报告重组慢病毒表达质粒(p LVX-8XCSL-ac GFP)。在人胚肾293T细胞中转染p LVX-8XCSL-ac GFP质粒或对照质粒p LVX-ac GFP,6 h后再转染Notch受体的细胞内结构域(NICD)的表达质粒p ETP-NICD(过表达NICD)或对照质粒p ETP。转染48 h后用荧光显微镜观察GFP的表达,用流式细胞仪进行荧光定量分析。然后将p LVX-8XCSL-ac GFP质粒及对照质粒包装成慢病毒转导前列腺癌细胞系LNCa P,72 h后荧光显微镜观察绿色荧光,用流式细胞仪分选出GFP荧光强度最强5%及最弱5%的细胞。提取这两部分细胞的RNA,采用qRT-PCR方法检测细胞中Notch1、Notch2以及Notch信号通路下游靶基因Hey1的表达。结果在转染p LVX-8XCSL-ac GFP的293T细胞中,转染p ETP-NICD的细胞荧光强度较转染p ETP对照质粒的细胞增加了约10倍;而在转染p LVX-ac GFP的293T细胞中,转染p ETP-NICD的细胞与转染p ETP对照质粒的细胞荧光强度无明显差异。根据p LVX-8XCSL-ac GFP荧光强度分选出的LNCa P细胞,荧光强度高的细胞Notch1、Notch2、Hey1表达高于荧光强度弱的细胞(P均<0.05)。结论在LNCa P细胞中p LVX-8XCSL-ac GFP可以作为报告Notch信号水平的有效工具。

淫羊藿素对BALB/c-nu裸鼠前列腺癌组织磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路及E-钙黏蛋白的影响

目的观察淫羊藿素对雄激素依赖型前列腺癌模型小鼠前列腺癌组织磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路及E-钙黏蛋白的影响并探讨其机制。方法雄性BALB/c-nu裸鼠40只,随机分为空白对照组、荷瘤组、LY294002组和淫羊藿素组,每组10只,除空白对照组外均采用含有2×107个/mL的人LNCaP前列腺癌细胞悬液前列腺内注射以建立前列腺癌LNCaP荷瘤鼠模型。2周后淫羊藿素组按80 mg/kg剂量尾静脉注射淫羊藿素治疗4周,PI3K/Akt抑制剂组尾静脉注射PI3K/Akt抑制剂LY294002,空白对照组、荷瘤组尾静脉注射等体积生理盐水。治疗结束后取前列腺组织,采用Western blotting检测磷酸化雄激素受体AR(p-AR)、磷酸化蛋白激酶(p-Akt)、雄激素受体剪接变异体7(AR-V7);免疫荧光双重染色(FITCCY3)法检测降钙素(Calcitonin)和钙黏蛋白E(E-cadherin)表达。结果荷瘤组前列腺组织p-AR和p-Akt均高表达,前列腺瘤组织芯片标本中AR-V7和Calctionin阳性率分别为(32.45±2.15)%和(46.31±5.01)%,E-cadherin阳性率(22.93±1.96)%,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。淫羊藿素组前列腺组织p-AR和p-Akt低表达,AR-V7和Calctionin阳性率分别为(17.02±1.23)%和(29.76±2.74)%,E-cadherin阳性率为(86.27±6.75)%,与荷瘤组比较差异有统计学意义(P<0.05)。LY294002组和淫羊藿素组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论淫羊藿素具有调控P13K/Akt信号通路的作用,主要通过调控p-AR、pAkt、AR-V7和Calctionin水平而影响前列腺癌LNCa P细胞侵袭和转移。