长链非编码RNA RP1-90L14.1对前列腺癌LNCaP细胞生物学行为的影响及其机制研究

目的:研究长链非编码RNA(lncRNA) RP1-90L14.1对前列腺癌LNCaP细胞增殖、迁移、侵袭的作用以及对GRIN2A、BACE2基因表达的影响。方法:采用RT-PCR检测前列腺癌LNCaP、LNCaP-AI细胞中RP1-90L14.1的表达水平;在LNCaP细胞中瞬时转染RP1-90L14.1过表达质粒和载体质粒,即转染RP1-90L14.1实验组(LNCaP-RP1-90L14.1组)和转染阴性对照组(LNCaP-NC组);采用普通培养液和活性炭吸附无酚红培养液培养两组细胞;CCK-8法、Transwell法检测两组细胞增殖、迁移、侵袭能力;RT-PCR和Western印迹检测两组细胞中N-甲基-D-天氡氨酸离子型谷氨酸受体2A(GRIN2A)、β位点淀粉样前体蛋白裂解酶2 (BACE2) mRNA和蛋白表达含量变化。结果:RP1-90L14.1在LNCaP-AI中的表达量显著高于LNCaP细胞(8.49±0.43 vs 2.53±0.95,P<0.05)。转染RP1-90L14.1后,LNCaP-RP1-90L14.1组RP1-90L14.1表达量显著高于LNCaP-NC组(0.71±0.22 vs 0.02±0.01,P<0.05);在普通培养液和活性炭吸附无酚红培养液中,培养72 h时,LNCaP-RP1-90L14.1组细胞活性分别高出LNCaP-NC组51.95%(1.22±0.08 vs 0.08±0.05,P<0.05)和50.69%(0.79±0.02 vs 0.53±0.05,P<0.05);培养96 h时,LNCaP-RP1-90L14.1组分别高出LNCaP-NC组51.72%(1.72±0.07 vs 1.13±0.05,P<0.05)和60.23%(1.18±0.05 vs 0.73±0.08,P<0.05)。转染RP1-90L14.1后,在普通培养液和活性炭吸附无酚红培养液中,细胞迁移能力LNCaP-RP1-90L14.1组均显著高于LNCaP-NC组[(682.0±42.7)个vs(422.0±37.1)个,(419.0±42.9)个vs(251.0±25.9)个,P<0.05];细胞侵袭能力LNCaP-RP1-90L14.1组也均显著高于LNCaP-NC组[(507.0±22.2)个vs(274.0±19.6)个,(352.0±14.1)个vs(216.0±14.3)个,P<0.05]。LNCaP-RP1-90L14.1组与LNCaP-NC组相比,GRIN2A mRNA和蛋白表达量(5.13±0.89、2.09±0.54,5.88±0.29、2.03±0.22),BACE2 mRNA和蛋白表达量(5.82±0.50、2.53±0.30,4.89±0.19、3.37±0.13)均有统计学差异(P<0.05)。结论:lncRNA RP1-90L14.1可能在调控前列腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭行为中起重要作用;RP1-90L14.1能促进GRIN2A、BACE2的表达;RP1-90L14.1与GRIN2A、BACE2可能存在内源性竞争关系。

垂体肿瘤转化基因1在雄激素非依赖性前列腺癌发生过程中的表达变化

目的:探讨垂体肿瘤转化基因1(PTTG1)在前列腺癌由激素依赖性转化为激素非依赖性过程中的表达变化。方法:通过在去雄激素培养条件下长期培养雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCa P,建立并验证雄激素非依赖性亚系LNCa P-AI细胞模型,用Western印迹、RT-PCR方法每2周检测在去雄激素培养过程中PTTG1的表达改变。结果:经过3个月培养,成功建立雄激素非依赖性亚系LNCa P-AI细胞模型;在LNCa P细胞中,随着去雄激素培养时间延长,PTTG1的表达水平逐渐升高,基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9表达有同步升高趋势。结论:PTTG1表达在雄激素非依赖性前列腺癌发生过程中逐渐增强,可能是晚期前列腺癌基因治疗的靶标之一。

Notch信号报告系统在前列腺肿瘤细胞系中的建立

目的在前列腺肿瘤细胞系LNCa P中建立Notch信号报告系统。方法采用In-Fusion酶系统将巨细胞病毒(CMV)启动子和Notch蛋白胞内结构域(ICD)细胞核内DNA结合蛋白CSL的8拷贝串联DNA序列克隆入p LVX-ac GFP-N1慢病毒载体,构建Notch信号报告重组慢病毒表达质粒(p LVX-8XCSL-ac GFP)。在人胚肾293T细胞中转染p LVX-8XCSL-ac GFP质粒或对照质粒p LVX-ac GFP,6 h后再转染Notch受体的细胞内结构域(NICD)的表达质粒p ETP-NICD(过表达NICD)或对照质粒p ETP。转染48 h后用荧光显微镜观察GFP的表达,用流式细胞仪进行荧光定量分析。然后将p LVX-8XCSL-ac GFP质粒及对照质粒包装成慢病毒转导前列腺癌细胞系LNCa P,72 h后荧光显微镜观察绿色荧光,用流式细胞仪分选出GFP荧光强度最强5%及最弱5%的细胞。提取这两部分细胞的RNA,采用qRT-PCR方法检测细胞中Notch1、Notch2以及Notch信号通路下游靶基因Hey1的表达。结果在转染p LVX-8XCSL-ac GFP的293T细胞中,转染p ETP-NICD的细胞荧光强度较转染p ETP对照质粒的细胞增加了约10倍;而在转染p LVX-ac GFP的293T细胞中,转染p ETP-NICD的细胞与转染p ETP对照质粒的细胞荧光强度无明显差异。根据p LVX-8XCSL-ac GFP荧光强度分选出的LNCa P细胞,荧光强度高的细胞Notch1、Notch2、Hey1表达高于荧光强度弱的细胞(P均<0.05)。结论在LNCa P细胞中p LVX-8XCSL-ac GFP可以作为报告Notch信号水平的有效工具。