人溶血磷脂酸受体1基因的克隆、表达载体构建及瞬时转染293T细胞

从人胃癌细胞中提取RNA然后反转录成cDNA,进而PCR克隆LPAR1(Lysophosphatidic Acid Receptor1)基因,亚克隆到pCR2.1载体,通过测序、酶切、连接到表达载体pIRES2-EGFP,通过酶切、测序鉴定获得pIRES2-EGFP-LPAR1重组质粒;表达载体以Lipofectamine2000介导转染293T细胞。用Real-time PCR法检测外源基因在293T细胞中表达,并通过ELISA检测LPAR1的活性。结果表明,克隆到LPAR1基因并获得了pIRES2-EGFP-LPAR1表达载体,在293T细胞中确认到LPAR1基因的过量表达,并通过LPAR1/Gi信号通路抑制cAMP形成加以验证所克隆LPAR1活性。LPAR1过表达细胞模型的建立,不仅为下一步对该受体功能研究奠定了基础,还使利用LPA剂量依赖性的抑制cAMP的线性关系定量LPA的细胞学方法成为可能。