抑制内质网钙离子释放在诱导巨噬细胞自噬及逆转LPS耐受中的作用

目的观察LPS耐受巨噬细胞自噬水平以及抑制内质网Ca 2+释放是否具有上调自噬水平和逆转LPS耐受的作用。方法分离Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞,LPS 5 ng/ml诱导耐受4 h,随后给予LPS 100ng/ml刺激,ELISA检测TNF-α和IL-6水平,Western blot和免疫荧光检测自噬蛋白(Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ)表达水平,Fluo-4 AM探针检测胞内Ca 2+浓度;在LPS刺激的同时给予胞内Ca 2+螯合剂(BAPTA)或内质网IP3通道阻断剂(2-APB)或CaMKⅡ抑制剂(KN-93),检测对自噬蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ表达以及TNF-α释放的影响。结果LPS耐受细胞经LPS再次刺激后,TNF-α、IL-6释放明显减少,自噬水平也显著下降,同时胞内Ca 2+水平异常增高;给予BAPTA或2-APB或KN-93能够降低胞内Ca 2+水平,上调LC3-Ⅱ/Ⅰ表达,增加TNF-α释放。结论LPS耐受的巨噬细胞自噬水平显著降低,抑制内质网Ca 2+通路是上调自噬水平并逆转LPS耐受的有效途径。

LPS耐受单核细胞中p50抑制IKKα结合于IL-1β启动子区

目的研究LPS耐受细胞中IL-1β启动子区p50对IKKα的作用，揭示pSO抑制IL-1β mRNA转录的机制。方法运用人单核细胞系THP-1模拟LPS耐受，使用染色体免疫沉淀（ChIP）和real—time PCR技术定量IL-1β启动子区pSO与IKKα的结合情况，并应用基因沉默技术研究p50和／或IKKα沉默后对IL-1β mRNA转录情况的影响。结果耐受细胞IL-1β启动子区p50结合并不减少，而IKKα结合降低；p50沉默后，IKKα的结合增加，同时IL-1β mRNA转录增加；pSO和IKKα双沉默后，IL-1β mRNA转录又降低。结论在耐受的THP-1细胞中，IL-1β mRNA转录的降低至少部分原因是由于pSO抑制了IKKα对IL-1β启动子区的结合而造成的。

一种简便的小鼠腹腔巨噬细胞内毒素耐受模型的建立

内毒素（LPS）耐受是生物在进化过程中形成的一种适应性防御机制，它可以使机体避免对LPS刺激的持续性反应，在感染性休克和脓毒症机体防御机制的建立中具有重要的作用。探讨LPS耐受建立的机制有助于深入认识机体的抗炎调节机制，可为与LPS介导的失控炎症反应性疾病的防治提供新的思路和依据。

TLR4胞内区的同源模建

目的 为进一步研究新发现的ＴＬＲ４蛋白在ＬＰＳ对机体细胞产生作用的机制，分析其Ｑ结构上的功能区域。方法 同源模建，通过计算机模拟从理论上对ＴＬＲ４胞内区的功能区域进行探讨。结果Ｐｒｏ７１２Ｈｉｓ突变体溶液可及表面的亲疏水性质有明显变化，且相应位置所带的电荷从中性变为正电荷。结论ＴＬＲ４胞内区在发生作用时，起主要作用的是疏水性作用，下一个接头蛋白ＭｙＤ８８与ＴＬＲ４胞内区相互作用的部位应当是一个有较强疏水作用的区域。这样当Ｐｒｏ７１２Ｈｉｓ突变体出现时，由于电荷的排斥，疏水作用无法达到点突变以前的强度，２个蛋白的结合不能得以实现，信号无法继续传递。从而出现对ＬＰＳ的耐受现象。

高迁移率族蛋白B1在内毒素／脂多糖耐受中的作用

胞外高迁移率族蛋白B1（HMGB1）被认为是重要的晚期炎症因子，在脓毒症的发生发展中起着重要作用。有研究表明，HMGB1预处理可以引起LPS耐受陋 以及肝脏与心肌细胞对缺血再灌注损伤的耐受睁。

内毒素耐受状态下胸腺CD4^+ SP细胞比例变化及意义

初步探讨内毒素耐受状态下胸腺CD4^+ SP细胞的比例变化及意义。以5mg/kg LPS腹腔注射C57BL/6小鼠,建立内毒素耐受模型。注射72h、8d后检测胸腺大小、重量及细胞总数;HE染色检测胸腺组织结构病理变化;FACS检测胸腺CD4^+单阳性(single positive,SP)细胞比例并计算总数变化,同时检测CD4^+SP细胞功能相关分子CD62L表达变化;PI染色法检测CD4^+SP细胞的凋亡情况。结果显示,与对照组相比,LPS注射72h后胸腺大小、重量及细胞总数均明显降低(P<0.05),且发生病理形态学异常;胸腺中CD4^+SP细胞比例显著增加,但数量减少(P<0.05);此外,CD4^+SP细胞的CD62L表达水平及凋亡比例明显增加(P<0.05)。LPS注射8d后胸腺大小、重量及细胞总数均与对照组相比差异不明显(P>0.05),且胸腺组织结构未见明显改变;然而,胸腺中CD4^+SP细胞比例及数量仍减少(P<0.05);且CD4^+SP细胞中CD62L表达水平降低。结果表明,在内毒素耐受状态下,胸腺CD4^+SP细胞比例发生显著改变,可能与细胞活化和凋亡变化有关。