基于表面等离子体共振(SPR)技术实时分析RGD基序与整联蛋白的相互作用

旨在研究口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)结构蛋白VP1上的RGD(Arg-Gly-Asp)基序与宿主细胞表面受体整联蛋白的结合特异性,作者应用基于表面等离子共振技术(SPR)的Biacore 3000系统实时研究RGD基序分别与猪源整联蛋白α_vβ_6胞外区结构域、α_v亚基胞外区结构域和β_6亚基胞外区结构域的亲和力。首先通过结合试验筛选与RGD基序有结合的整联蛋白结构域,再对有结合的整联蛋白与RGD基序开展动力学分析。结果显示,合成的RGD基序与猪源整联蛋白α_vβ_6胞外区结构域有结合,结合动力学常数K_a、K_d、K_D分别为42.3 M~(-1)s~(-1)、3.1×10~(-4)s~(-1)和7.33×10~(-6)M;与整联蛋白α_v亚基胞外区结构域之间亦有结合,结合动力学常数K_a、K_d、K_D分别为21.8 M~(-1)s~(-1)、2.13×10~(-4)s~(-1)和9.79×10~(-5)M;与β_6亚基胞外区结构域几乎没有结合。综上表明,RGD与整联蛋白α_vβ_6胞外区结构域的结合比与整联蛋白α_v亚基胞外区结构域之间的结合快且亲和力强。本研究将为进一步探讨FMDV与宿主细胞表面受体的相互作用提供参考。

食源性单增李斯特菌LPXTG蛋白基因的检测

单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)作为四大重要食源性病原菌之一,对人类及多种畜禽健康威胁极大。LM细胞胞壁表面分布多种毒力蛋白,在感染机体过程中发挥重要作用,其中有一类至关重要的表面蛋白其C末端含有保守基序LPXTG,分选酶A能够识别基序LPXTG,共价结合到肽聚糖上,呈现在细胞表面发挥毒力作用。本试验以不同食品中分离得到的24株单增李斯特菌为试验对象,设计合成了41对预测含LPXTG基序表面蛋白的引物,利用PCR技术进行扩增,凝胶电泳成像系统检测扩增产物片段大小,计算24株食品源单增李斯特菌LPXTG基序表面蛋白的携带。结果表明,不同LM分离株LPXTG蛋白基因的携带率不同:其中仅有12.5%(3/24)的分离株携带率在85%以上;不同LPXTG蛋白基因的检出率不同,在41个检测对象中,有8个基因的检出率100%,有3个基因的检出率不足20%,Lmo1115基因在所有分离株中均未检测到。本研究对了解食品源LM分离株的LPXTG蛋白基因的分布以及探明食品源LM的致病性具有重要意义。

猪链球菌蛋白表面展示系统的构建及展示蛋白的初步观察

为构建猪链球菌(Streptococcus suis)蛋白表面展示系统,本研究通过序列分析,确定猪链球菌的LPxTG蛋白及其信号肽(SP)和胞壁锚定基序(CWA),通过PCR扩增Peno-SP、GFP、CWA的DNA片段并融合,构建强启动子Peno控制表达编码SP-GFP-CWA融合蛋白的DNA片段,将该重组DNA片段连接pSET2载体,获得蛋白表面展示质粒,转化猪链球菌,构建得到以GFP为报告蛋白的猪链球菌蛋白表面展示系统。结果显示,利用猪链球菌的10个LPxTG蛋白及其SP和CWA序列,构建了10个含有Peno-SP-GFP-CWA融合片段的重组pSET2表面蛋白展示质粒pSsPSD1至pSsPSD10,分别转化猪链球菌05ZYH33,PCR鉴定显示其中7个转化猪链球菌。采用western blot初步检测其展示蛋白,结果显示,7个转化阳性菌株均能有效表达GFP蛋白,以成熟GFP条带为指标,均表现出了一定的外源GFP表面展示水平,分别命名为SsPSD1、SsPSD2、SsPSD4、SsPSD7-SsPSD10,其中SsPSD1、SsPSD4、SsPSD8和SsPSD9表面展示水平相对较好,在猪链球菌表面展示外源蛋白方面具有很好的潜力。本研究首次尝试建立猪链球菌蛋白表面展示系统,为猪链球菌表面递呈外源蛋白或抗原提供了新的策略。

猪链球菌LPxTG蛋白HP0197与外源蛋白的融合表达及融合蛋白抗原活性的检测

为了从蛋白水平探究猪链球菌(S. suis)的表面LPxTG(Leu-Pro-x-Thr-Gly,x表示任何氨基酸)蛋白HP0197在S. suis表面展示外源抗原的可行性,本研究分别经PCR扩增HP0197蛋白的功能区编码基因片段hp0197(去除了HP1097全长蛋白aa1~aa40的转运信号肽序列和aa524~aa56的CWA基序)、hp0197-18 ku基因片段(即HP0197蛋白的18 ku结构域的编码基因)、hp0197-Loop基因片段(HP0197蛋白aa201~aa523的编码基因片段),并通过融合PCR将gfp基因融合至上述两段基因即HP0197蛋白的18 ku结构域和Loop区编码基因之间,并构建表达HP-GFP融合蛋白的重组质粒及表达HP0197蛋白的重组质粒,经测序鉴定后将其分别转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导后采用SDS-PAGE鉴定。采用Ni-NTA亲和树脂方法纯化HP0197蛋白和HP-GFP融合蛋白后分别免疫小鼠,经间接ELISA检测首免后不同时间各组小鼠血清中的HP0197抗体和GFP抗体水平,评价HPGFP融合蛋白和HP0197蛋白的抗原活性。SDS-PAGE结果显示,分别经原核系统表达并纯化了HP-GFP融合蛋白和HP0197蛋白。间接ELISA结果显示,单独免疫HP0197蛋白的小鼠产生了HP0197抗体,但未产生GFP抗体;而免疫HP-GFP融合蛋白的小鼠,既产生了HP0197抗体,也产生了GFP抗体,且在首免后28 d这两种抗体效价均达1:204 800。上述结果表明在HP0197蛋白的18 ku结构域和Loop区之间插入外源蛋白,可在保留HP0197蛋白自身抗原活性的前提下,有效发挥外源蛋白的抗原活性。本研究首次在蛋白水平上证实了S. suis的LPxTG蛋白HP0197作为载体蛋白用于在S. suis表面展示外源蛋白的可行性,为进一步构建S. suis表面蛋白展示系统奠定了基础。

产单核细胞李斯特菌p60蛋白N端肽聚糖结合基序在枯草芽孢杆菌中的表达

目的:构建产单核细胞李斯特菌胞外蛋白p60的N端肽聚糖结合基序(p60-N)表达载体,实现其在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。方法:将目标基因克隆到表达载体pHT43中获得重组载体pHT43-p60-N,转化枯草芽孢杆菌WB800N获得重组工程菌株WB800N/pHT43-p60-N,在此基础上考察IPTG浓度、培养基、表达时间和温度等条件对目标蛋白表达的影响。结果:p60-N蛋白可在枯草芽孢杆菌中分泌表达,与鼠李糖乳杆菌形成的革兰阳性增强基(GEM)颗粒特异性结合,具有与天然蛋白类似的生物学活性。用GB培养基,在37℃下,加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG诱导12~20 h,表达量提高到28 mg/L。结论:实现了p60蛋白N端基序在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,为进一步研究以该蛋白为基础的细菌样颗粒疫苗奠定了基础。

乳酸乳球菌表面展示技术中锚定基序应用的研究进展

目的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)作为公认的食品安全级微生物,已被用于生活的诸多方面。表面展示技术的发展为L.lactis在活菌疫苗、疾病诊断及固定化酶等方面的研究带来了全新的方向。但在L.lactis表面展示的过程中存在较多问题,其中之一就是锚定基序的选择。本文主要就L.lactis表面展示系统中锚定基序的选择及应用作一综述。