Survivin启动子控制LRIG1基因表达的重组腺病毒对人膀胱癌裸鼠移植瘤的治疗

【目的】探讨Survivin启动子控制LRIG1基因表达的重组腺病毒对人膀胱癌裸鼠移植瘤的治疗作用及机制。【方法】建立膀胱癌裸鼠移植瘤模型,将成瘤裸鼠随机分为3组,Ad-Surp-LRIGl组(尾静脉注射Ad-Surp-LRIGl上清液)、AD-LRIG1组(尾静脉注射Ad-LRIGl上清液)、PBS组(尾静脉注射PBS),观察各组裸鼠移植瘤生长情况并绘制肿瘤生长曲线;RT-PCR和Western blot分别检测各组肿瘤组织中LRIG1和EGFR mRNA和蛋白的表达。【结果】Ad-Surp-LRIGl组肿瘤生长速度明显慢于其他2组,治疗结束后Ad-Surp-LRIGl组肿瘤较其他2组轻,差异有统计学意义(F=97.86,P<0.001),Ad-LRIGl组与PBS组相比差异无统计学意义(t=1.73,P=0.06)。与其他两组相比,Ad-Surp-LRIGl组LRIG1的mRNA和蛋白表达水平明显升高,而EGFR的mRNA和蛋白表达水平则显著降低(P<0.01)。【结论】Ad-Surp-LRIGl在体外均能明显抑制膀胱癌的生长,其机制可能部分与LRIG1能下调EGFR的表达有关。

Survivin启动子驱动LRIG1基因表达的重组腺病毒对人膀胱癌细胞BIU87生长的影响

目的:构建Survivin启动子驱动LRIG1基因表达的重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl,并检测其对人膀胱癌细胞BIU87生长的影响。方法:将经同源重组产生的重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度。用Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl分别感染人膀胱癌细胞BIU87及人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1,MTT法评估Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl对BIU87细胞生长的抑制作用。结果:当感染复数(MOI)=25时,Ad-Surp-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率为74.56%,在SV-HUC-1细胞中转染率为0,差异有统计学意义(χ2=58.64,P<0.05);Ad-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率为68.27%,在SV-HUC-1细胞中转染率为72.52%,差异无统计学意义(χ2=0.075,P>0.05)。Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率相比,差异无统计学意义(χ2=0.016,P>0.05)。与PBS相比,Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl均能明显抑制BIU87细胞的生长,转染后第4天这一差异显著(F=15.96,P<0.05),而Ad-Surp-LRIGl组和Ad-LRIGl组细胞生长速度无明显差异。结论:成功构建了含有Survivin启动子驱动LRIG1基因的重组复制腺病毒Ad-Surp-LRIGl并鉴定正确,Ad-Surp-LRIGl能选择性转染人膀胱癌细胞BIU87,在体外能明显抑制膀胱癌细胞BIU87的生长。

LRIG1基因过表达慢病毒载体的构建和鉴定

目的探讨构建人类富含亮氨酸重复和免疫球蛋白样结构域1(LRIG1)基因过表达慢病毒表达载体并转染胶质瘤细胞系U87细胞的技术方法,为研究LRIG1的功能提供帮助。方法用EcoRⅠ及BamHⅠ双酶切LRIG1基因和plvxDsRed-monomer-n1慢病毒载体,琼脂糖凝电泳回收LRIG1片段和载体片段;通过T4连接酶将LRIG1基因连接至慢病毒载体上;按Lenti-XHT慢病毒包装试剂盒说明包装慢病毒;用EcoRⅠ及BamHⅠ双酶切法鉴定重组慢病毒载体;然后用plvxDsRed-monomer-n1和plvxDsRed-monomer-n1-3×flagLRIG1分别转染293T细胞和胶质瘤细胞系U87细胞,荧光定量PCR和western blot检测LRIG1 m RNA和蛋白表达。结果 U87细胞感染病毒载体后经嘌呤霉素筛选显示细胞红色荧光较空载体感染细胞减弱;实时PCR结果显示LRIG1 m RNA过表达组较对照明显升高;提取感染后细胞蛋白,Western blot鉴定flag标签蛋白表达成功。结论 LRIG1基因慢病毒表达载体能感染胶质瘤细胞系U87细胞,可使外源基因获得稳定表达。

Survivin启动子驱动LRIG1基因表达的重组腺病毒对人膀胱癌细胞T24侵袭能力的影响

目的以Survivin启动子驱动LRIG1基因表达的重组腺病毒Ad-Surp-LRIG1转染人膀胱癌细胞系T24细胞,观察其对T24细胞侵袭能力的影响。方法 Ad-Surp-LRIG1转染T24细胞,用RT-PCR和Westernblot检测细胞中LRIG1的表达水平,并采用Transwell小室测定转染后细胞侵袭能力的变化。结果 Ad-Surp-LRIG1转染人膀胱癌T24细胞后,与对照组和空白对照组相比,体外侵袭实验显示实验组细胞的侵袭能力明显下降。LRIG1的mRNA和蛋白表达水平明显升高,而EGFR的mRNA和蛋白表达水平则显著降低(P<0.01)。结论 Survivin启动子驱动LRIG1基因表达的重组腺病毒Ad-Surp-LRIG1能够在T24细胞中有效表达,并显著抑制T24细胞的侵袭能力。

Survivin启动子驱动的LRIG1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建含Survivin启动子和LRIG1基因的重组复制缺陷型腺病毒并进行鉴定,为肿瘤基因治疗的研究奠定基础。方法应用分子克隆技术将Survivin启动子连接至pLRIGl-GFP上构建出pEGFP-Surp-LRIGl,将其与含有5型腺病毒右臂的质粒Pbhge3通过Lipofectamine2000共转染至人胚肾293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl。Ad-Surp-LRIGl在人胚肾293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度。结果 pEGFP-Surp-LRIGl经酶切鉴定正确,扩增得到的Ad-Surp-LRIGl经PCR扩增证实为Survivin启动子驱动的LRIG1重组腺病毒,滴度为2.3×1010pfu/ml。结论成功构建出含有Sur-vivin启动子和LRIG1基因的重组复制缺陷型腺病毒并鉴定正确,可用于下一步膀胱癌基因治疗的研究中。

LRIG1基因功能域载体的构建及亚细胞定位

目的构建含LRIG1胞外段+跨膜段(ET)及跨膜段+胞内段(TC)基因的真核表达载体,并研究它们的亚细胞定位。方法以人LRIG1全长的质粒p3XFLAG-CMV-9-LRIG1为模板,PCR扩增出3XFLAG-LRIG1-ET和LRIG1-TC,并将之分别亚克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP-N1和p3XFLAG-CMV-9中。酶切和DNA测序鉴定,脂质体法将构建的质粒转染U251细胞,观察标记基因荧光蛋白EGFP的表达,间接免疫荧光检测标记基因3XFLAG的表达。结果构建的质粒序列正确,转染细胞后可检测到EGFP和3XFLAG基因的表达;LRIG1-ET和LRIG1-TC均主要表达在U251的胞膜上,少量表达在胞浆。结论包含LRIG1亚单位ET和TC的真核表达载体均构建成功,其表达产物均主要位于胞膜,少量位于胞浆。

Survivin启动子驱动腺病毒介导LRIG1基因治疗前列腺癌的体外实验

目的由于去势抵抗性前列腺癌(CRPC)缺乏有效治疗方法,因此催生了探索新治疗模式的需求,其中靶向基因治疗可能是治疗CRPC的较理想模式;但是CRPC的靶向性基因治疗尚没有受到应有的关注。本课题拟研究Survivin启动子驱动的重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl对前列腺癌细胞株的体外治疗效果。方法用Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl分别感染人前列腺癌细胞PC-3M及人前列腺上皮细胞CRL-11609RWPE-1,根据报告基因EGFR表达的不同计算病毒的细胞转染率。MTT法评估Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl对PC-3M细胞生长的抑制作用。结果当MOI=25时,Ad-Surp-LRIGl在PC-3M细胞中的转染效率为81.24%,在CRL-11609RWPE-1细胞中转染率为0,在两种细胞内的转染率比较差异有显著性意义(χ2=65.18,P=0.000);Ad-LRIGl在PC-3M细胞中的转染效率为77.22%,在CRL-11609RWPE-1细胞中转染率为71.68%,转染率比较差异无显著性意义(χ2=0.051,P=0.802)。Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl在PC-3M细胞中的转染率相比,差异无显著性意义(χ2=0.013,P=0.796)。在常规培养1d后PBS组的细胞生长速度即开始超过Ad-Surp-LRIGl组和Ad-LRIGl组细胞,4d后细胞生长速度差异显著(χ2=15.37,P=0.001),而Ad-Surp-LRIGl组和Ad-LRIGl组细胞生长速度无明显差异。结论 Ad-Surp-LRIGl能选择性转染人前列腺癌细胞PC-3M,能明显抑制体外前列腺癌细胞的生长。

LRIG1基因对胶质瘤SHG44的放疗增敏作用

目的研究亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1(LRIG1)对人脑胶质瘤细胞系44细胞(SHG44)的放疗增敏作用。方法采用分子克隆技术,将构建的重组质粒p EGFP-C1-LRIG1转染SHG44,并稳定表达后在荧光显微镜下观察;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术研究放射照射后SHG44中目的基因LRIG1和表皮生长因子受体(EGFR)的信使核糖核酸(mRNA)表达情况;免疫组织化学法分析照射后SHG44中LRIG1和EGFR的蛋白表达差异;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分析干预后SHG44的细胞增殖能力;细胞侵袭实验(Transwell)分析干预后SHG44的肿瘤侵袭能力。结果重组质粒p EGFP-C1-LRIG1转染SHG44细胞可稳定表达LRIG1;SHG44+p EGFP-C1-LRIG1细胞相对于SHG44、SHG44+p EGFP-C1细胞,LRIG1与EGFR基因的mRNA和蛋白的表达水平有显著差异(P<0.01);且SHG44+p EGFP-C1-LRIG1细胞的细胞活性及侵袭能力较SHG44、SHG44+p EGFP-C1细胞明显下降(P<0.01)。结论在胶质瘤SHG44细胞中过表达LRIG1基因可通过下调EGFR表达,抑制SHG44细胞的恶性生物学行为,增加放疗敏感性。

富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域1(LRIG1)基因在非小细胞肺癌中的表达、信号通路及其与预后的关系

目的:探讨富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域1(LRIG1)基因在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的表达、相关信号通路及其与患者预后的关系。方法:依靠癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析LRIG1基因mRNA在NSCLC患者癌组织和癌旁组织中的表达水平;依靠蛋白相互作用(STRING)数据库构建LRIG1蛋白-蛋白相互作用网络,并对相关蛋白功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路进行富集。同时分析比较LRIG1基因表达与NSCLC患者总生存期和无疾病进展生存期的关系。选取手术治疗的96例NSCLC患者,采用免疫组织化学法检测LRIG1蛋白在癌组织和癌旁组织中的表达,对数据库分析结果进行验证。结果:LRIG1基因在癌旁正常组织中表达水平较高,而在癌组织中表达较低;与LRIG1蛋白相互作用较为紧密的10蛋白相互作用网络富集显著(P<0.001);共表达分析显示,L-型电压依赖性钙离子通道α1D亚基(CACNA1D)基因与LRIG1基因正向共表达最为明显(r=0.51,P<0.05),而G蛋白信号转导调节因子20(RGS20)基因与LRIG1基因负向共表达最为明显(r=–0.49,P<0.05);LRIG1基因生物学过程、细胞成分和分子功能主要分别富集于表皮生长因子受体信号通路的负调控、胞质囊泡部和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶活性等;LRIG1基因主要富集于癌症中的蛋白多糖、内吞作用、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K-AKT)信号通路、Ras相关蛋白1(RAP1)信号通路、癌症的途径和ras等肿瘤相关信号通路;LRIG1基因mRNA高表组患者的总生存期高于低表达组[(风险比(HR)=0.74,P<0.05)],而两组的无疾病进展生存期差异无统计学意义(HR=1.0,P=0.97);LRIG1蛋白在NSCLC癌旁组织的阳性表达率显著高于癌组织(P<0.05)。LRIG1蛋白高表达与NSCLC患者临床分期、肿瘤大小及纵膈淋巴结转移有关(P<0.05)。结论:LRIG1基因在NSCLC癌组织中低表达,并与患者肿瘤大小、淋巴结转移及总生存期有关。

LRIG1和EGFR在食管鳞状细胞癌中的表达与意义

目的探讨富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1（LRIG1）和表皮生长因子受体（EGFR）在食管鳞癌中的表达与意义。方法应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测46例食管癌肿瘤组织LRIG1和EG—FR基因的表达情况，并与46例癌旁正常组织进行比较分析。结果食管癌组织中LRIGImRNA的表达水平（0．35±0．04）低于相应癌旁正常组织（0．67±0．07），P〈0．05；食管癌组织中EGFRmRNA的表达水平（2．23±0．25）高于相应癌旁正常组织（1．88±0．21），P〈0．05；食管癌组织、相应癌旁正常组织中LRIG1mRNA和EGFRmRNA的表达水平呈负相关，差异有统计学意义（r=-0．662，P〈0．05）。结论LRIG1mRNA在食管癌组织中存在低表达，提示其有可能具有抑癌作用。EGFRmRNA在食管癌组织中存在高表达，且LRIG1mRNA和EGFRmRNA二者之间呈负相关，提示LRIGmRNA表达下降可能导致EGFR活化，从而促进食管癌的发生发展。

Lrig1在结肠癌组织和细胞株中表达意义

目的探讨富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1(Lrig1)在结肠癌组织和细胞株中的表达,并比较其与正常结肠组织和正常结肠上皮细胞表达的差异性。方法采用免疫组化、逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)和蛋白印迹(WB)方法检测结肠癌组织和癌旁正常组织以及各细胞株中的表达水平,并比较其差异性。结果免疫组化结果显示,结肠癌组织中Lrig1的表达水平(31.43%,22/70)明显低于癌旁正常结肠组织(86.11%,31/36)。Lrig1在结肠癌组织中的表达与分化、分期及有无淋巴结转移有关(P<0.05),与性别、年龄和肿瘤大小无关(P>0.05)。RT-PCR结果显示,与正常肠上皮细胞株NCM460(0.95±0.12)比较,Lrig1 mRNA在结肠癌细胞株SW480和HCT116中相对表达量降低,分别为(0.65±0.09)和(0.47±0.06),组间比较具有统计学意义(P<0.05)。WB的结果显示,与NCM460(0.98±0.16)比较,Lrig1蛋白在SW480和HCT116细胞中的相对表达量降低,分别为(0.71±0.06)和(0.54±0.05),组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 Lrig1在结肠癌的发生和发展中可能起着抑癌基因的作用。

LRIG1基因与恶性肿瘤的研究进展

LRIG1是新近发现的一种肿瘤细胞的抑制因子,通过负反馈调节酪氨酸激酶受体信号转导通路抑制细胞过度增殖及侵袭转移。它在多种恶性肿瘤患者的血清中均有不同程度减少,与肿瘤的发生发展密切相关,有望成为肿瘤诊断及治疗的潜在靶点。本文对LRIG1基因结构、基因调控和LRIG1与常见恶性肿瘤关系的研究进展进行综述。