一个新的白血病相关基因LRP16全长cDNA的克隆、序列分析及表达特征

克隆一个与白血病复发相关基因 (LRP1 6)的全长 c DNA序列 ,对其进行染色体定位、组织表达谱分析 ,并对该基因编码蛋白质进行原核表达 .首先用获得的一段 3kb DNA片段在 NCBI提供的 h ESTs数据库中进行电子杂交并对重叠克隆片段组装 ,再设计引物进行 c DNA末端快速扩增(RACE技术 ) .采用 Northern印迹方法进行组织表达分析 .以高通量基因组序列 (HTGS)数据库为基础进行染色体定位 .对构建的克隆菌用 IPTG诱导重组蛋白表达后进行 SDS- PAGE,同时对重组体测序确证 .钓取了该基因全长 c DNA、推导所编码的氨基酸序列 ,并将该基因定位于染色体1 1 q1 2 .2 .原核表达筛选获得了该基因重组子的一个缺失体 .对 LRP1 6基因全长 c DNA的序列分析提示 ,该基因可能编码两种 N端不同的蛋白质 ,且该基因的转录本可能存在一种丰度较低的剪接体 .

LRP16编码蛋白的信息学分析及亚细胞定位研究

目的 :探讨LRP16基因编码蛋白的基本生物学特征及其在真核细胞中的分布。方法 :以Internet为操作平台、以国际公共生物数据库为实验材料、应用生物学软件为研究工具对LRP16编码蛋白进行了全方位的生物信息学分析。在此基础上 ,将该基因的编码序列重组到pEGFP N1真核表达中 ,融合在绿色荧光蛋白 (GFP)的N端转染HeLa细胞 ,激光共聚焦显微镜观察荧光分布。结果 :LRP16编码产物主要与一些RNA病毒产生的与核酸结合的非结构蛋白有较高相似性 ,含有与功能未知的Motif:Hismacro、DUF2 7、A1pp相似的结构域。激光共聚焦显微镜扫描发现GFP分布于细胞核内。结论 :LRP16基因编码一种起源古老、进化缓慢的核蛋白因子 。

LRP16与ART-27的相互作用的鉴定

目的:鉴定LRP16与ART-27的相互作用,推测LRP16基因在肿瘤发生、发展中涉及到的信号途径。方法:酵母双杂交系统筛选出ART-27可与LRP16相互作用,采用酵母双杂交回复验证、免疫共沉淀及GST pull-down等体内、体外方法对二者之间的相互作用进行验证。结果:LRP16与ART-27在体内、体外均可形成复合物。结论:ART-27是LRP16的特异性结合蛋白,二者的相互作用为进一步研究LRP16在胚胎发育及肿瘤发生、发展中的功能及信号传导途径奠定了基础。

Macro Domain家族成员LRP16是多种核受体的相互作用因子

LRP16基因是macro domain家族成员之一,C末端含有唯一的1个保守的功能结构域.既往研究表明,该基因具有雌激素反应性,并可通过与雌激素受体α(ERα)相互作用调控其转录活性.近期我研究组发现,LRP16可与雄激素受体(AR)的共激活因子ART-27相互作用.本研究首先通过GST pull-down方法验证LRP16/ART-27/AR三者之间相互作用关系,并用免疫共沉淀实验明确了LRP16与AR存在直接的相互作用,且这种相互作用并不依赖于ART-27的存在;采用GST pull-down进一步明确LRP16与AR相互作用的结构域.结果发现,LRP16通过C端的macro domain结构域与AR的LBD域相互作用;鉴于核受体家族有较高程度的氨基酸序列保守性与功能结构域的相似性,通过GST pull-down验证了LRP16与核受体超家族成员ERβ、GR、PPARα、PPARγ的相互作用,提示LRP16至少还可与ERα以外的5个核受体家族成员相互作用;进一步采用核受体荧光素酶报告基因转染细胞,通过检测荧光素酶活性证实LRP16可增强AR、GR、ERβ、PPARα、PPARγ的转录激活活性.本研究初步证实,macro domain家族成员LRP16可与多个核受体相互作用,并增强其转录激活活性,是核受体家族的共激活因子,为进一步研究LRP16在核受体转录调控中的生理病理学功能奠定基础.

角蛋白KRT18对LRP16亚细胞定位的影响

目的:通过构建LRP16绿色荧光蛋白(GFP)融合子,观察LRP16蛋白在乳腺癌MCF-7、小鼠成纤维NIH3T3细胞株中的亚细胞定位,研究角蛋白18(Cytokeratin18,KRT18)对LRP16亚细胞定位的影响,并利用Western-blot对KRT18能够调控LRP16核浆穿梭进一步验证。方法:构建真核表达载体pEGFP-LRP16,经脂质体介导pEGFP-LRP16质粒单独转染,与携带KRT18基因的Flag-pCDNA3-KRT18质粒共同转染NIH3T3、MCF-7细胞,荧光显微镜观察LRP16的亚细胞分布变化。Western-Blot法进一步验证在KRT18过表达和小干扰(siRNA)技术沉默掉KRT18后对内源性LRP16蛋白核浆分布的影响。结果:成功构建pEGFP-LRP16融合载体,荧光显微镜观察LRP16蛋白在MCF-7细胞呈核型分布为主,在NIH3T3细胞呈浆型分布为主。与KRT18共同转导后LRP16亚细胞分布趋向细胞浆。Western blot分析证实角蛋白18会介导内源性LRP16由核向浆穿梭的生物学功能。结论:KRT18通过与LRP16相互作用将LRP16扣留在细胞浆,是影响LRP16亚细胞分布的关键因子。为进一步研究KRT18对LRP16翻译后核功能执行的调控机制奠定了基础。

LRP16蛋白在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化中表达量的变化

目的 LRP16蛋白在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中表达量的变化及胰岛素对脂肪细胞LRP16蛋白表达的调控。方法经典脂肪细胞诱导方案诱导前脂肪细胞为成熟脂肪细胞,每天(0-8d)均留取蛋白标本。不同浓度(0、1、10、100nmol/L)胰岛素刺激脂肪细胞24h,分别留取蛋白标本。Western-Blot方法检测样本中LRP16蛋白的表达量。结果 LRP16蛋白在前脂肪细胞无表达或极低表达,从诱导的第3、4天开始表达,迅速升至高峰,此后维持在高表达水平。LRP16蛋白在第6-8天之间表达水平无统计学差异(P>0.05),其余各时段间表达水平均有显著差异(P<0.01)。不同浓度胰岛素刺激脂肪细胞24h,细胞中LRP16蛋白表达量与胰岛素浓度呈负相关(P<0.01)。结论 LRP16蛋白随着前脂肪细胞分化的开启,表达量从无到有逐渐增加至高峰,并一直维持在高表达水平;胰岛素(INS)负调控脂肪细胞LRP16蛋白的表达。

LRP16基因通过上调GLUT-2促进MIN6细胞胰岛素分泌

目的:探讨LRP16基因对MIN6细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响及其可能机制。方法:用Super-Fect脂质体转染法建立稳定过表达LRP16基因的MIN6细胞株,以转染空质粒的MIN6细胞株作为对照。检测两组细胞的增殖、胰岛素分泌及GLUT-2蛋白的表达情况。结果:过表达组的增殖与对照组相比无显著差别(P>0.05);在0mmol/L、3mmol/L、30mmol/L葡萄糖刺激下,过表达组的胰岛素分泌量分别为对照组的2.26倍、2.19倍和2.16倍(P<0.05);westernblot显示过表达组GLUT-2蛋白量比对照组显著上调(P<0.05)。结论:过表达LRP16基因不能促进MIN6细胞增殖,但可以通过上调GLUT-2促进胰岛素分泌。表明LRP16基因促进胰岛素分泌的作用不依赖细胞增殖,而依赖细胞对葡萄糖摄取的增加。

白血病相关蛋白16亚细胞定位的研究

目的:研究白血病相关蛋白LRP16基因编码蛋白在真核细胞内的亚定位分布。方法:将LRP16全长基因序列(长型/L型)与LRP16天然缺失体编码序列(短型/S型)融合到绿色荧光蛋白pEGFP真核表达载体的N端,转染鼠成纤维NIH3T3、人乳腺癌MCF-7细胞株,观察绿色荧光的分布;采用细胞免疫荧光染色(CIF)方法和激光共聚焦显微镜进一步鉴定内源性LRP16蛋白在上皮起源性肿瘤乳腺癌MCF-7、宫颈癌Hela,人胚肾293T细胞株的亚细胞分布。结果:绿色荧光融合蛋白LRP16-pEGFPL型在NIH3T3细胞系中以细胞浆型分布为主,在MCF-7中以细胞核型分布为主,绿色荧光融合蛋白LRP16-pEGFPS型在真核细胞内呈核浆均匀分布;CIF染色结果表明内源性LRP16(长型/L型)蛋白在MCF-7、Hela和293T细胞中分别亚定位于细胞核。结论:LRP16是在上皮起源性肿瘤细胞中作为核因子参与其进展,野生型LRP16(长型/L型)前82个氨基酸在决定LRP16亚定位方面发挥关键作用。