猪LTβR基因克隆、结构功能预测、组织表达谱分析及真核表达载体构建

为了进一步探究猪LTβR基因的生物学功能,本研究以猪淋巴组织cDNA为模板扩增LTβR基因CDS区,进一步利用生物信息学对猪LTβR蛋白结构与功能以及参与的GO和Pathway通路进行分析,利用Real-time PCR检测LTβR基因在大白猪不同组织中的表达水平,同时将LTβR基因扩增产物克隆至真核表达载体pEGFPC1中,并分别转染猪HEK293和IPEC-J2小肠上皮细胞系,通过显微镜观察其表达情况。结果表明,克隆获得猪LTβR基因CDS区全长为1 209bp,编码402个氨基酸,发现LTβR为脂溶亲水性的不稳定蛋白,存在1个跨膜结构(205~227aa),不存在信号肽,亚细胞定位表明LTβR为非分泌型蛋白。LTβR蛋白具有2个糖基化位点,18个潜在的磷酸化位点,其中包括PKC、CKI、CDC2、GSK3、CDK5、INSR等10种保守的特异性蛋白质激酶的结合位点。该蛋白保守区域为2个TNFR superfamily,分别位于32~125和128~192位氨基酸,并发现C422T>A141V突变位于该区域内。KEGG和GO分析发现,LTβR基因共参与12项GO功能分类,同时还参与NF-kappa B信号通路、IgA合成的肠道免疫网络等5项调控通路。定量检测发现,LTβR基因在大白猪肺中的表达水平极显著高于其他组织(P<0.01),在肾和脾等免疫器官,十二指肠和空肠等肠道组织中也均有较高的表达水平。细胞水平转染试验及显微镜观察发现其在猪HEK293和IPEC-J2两种细胞中均表达。本研究为猪LTβR基因及其介导的信号通路的功能分析提供了材料和依据,今后有必要在细胞水平上进一步验证分析猪LTβR基因及其介导的信号通路在猪抵抗细菌感染过程中发挥的重要作用,同时将C422T突变作为猪抗病育种的一个潜在遗传标记进行系统分析。

不同日龄苏太仔猪LTβR基因组织表达谱及发育性表达规律分析

试验旨在探讨LTβR基因在仔猪出生至断奶期间的mRNA表达变化,为进一步研究该基因与F18大肠杆菌致病的相关性提供理论依据。本试验选取从初生到断奶的4个日龄(8、18、30和35日龄)苏太仔猪各4头,利用实时荧光定量PCR方法分别比较分析了LTβR基因在各个体11个组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肌肉、胸腺、淋巴结、十二指肠及空肠)间的表达规律。结果表明,LTβR基因在肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、淋巴结、十二指肠及空肠组织中呈现较高水平的表达,并且表现出明显的发育性表达差异。LTβR基因在8日龄仔猪淋巴、十二指肠和空肠组织中的表达极显著高于其他日龄(P<0.01);在8日龄仔猪肺脏组织中的表达极显著高于35日龄(P<0.01),且显著高于30日龄(P<0.05);在35日龄仔猪肝脏组织中的表达极显著高于其他日龄(P<0.01);在35日龄仔猪胃组织中的表达显著高于18日龄(P<0.05)。由此推测,8日龄左右为仔猪肠道免疫屏障快速形成期,LTβR基因的较高表达可能有利于仔猪对F18大肠杆菌抗性。

LTβR基因在大肠杆菌F18抗性型和敏感型苏太仔猪间的差异表达分析

旨在探讨LTβR基因在苏太断奶仔猪各组织间的mRNA表达谱,并比较分析该基因在大肠杆菌F18抗性/敏感型群体间的表达差异,为进一步探讨该基因的功能及筛选断奶仔猪大肠杆菌F18抗性遗传标记提供一定的指导和依据。试验分别挑选35日龄大肠杆菌F18抗性/敏感型苏太断奶仔猪各4头,利用实时荧光定量PCR方法比较分析LTβR基因在11个组织(心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、胸腺、淋巴结、十二指肠、空肠)间的表达差异。结果:LTβR基因在检测的11个组织中均有表达,其中在肝、肺、肾、胃、十二指肠和空肠呈现高水平表达,在脾和淋巴结中呈现中等水平表达,在心脏、肌肉和胸腺组织中呈现低水平表达。除肝脏外,LTβR基因在抗性型个体中表达量普遍高于敏感型个体,而且在肠系膜淋巴结中的表达量极显著高于敏感型个体(P<0.01)。由此推测,LTβR基因的表达上调有利于断奶仔猪抵御大肠杆菌F18的感染,且可能是通过在淋巴结组织中的高表达维持和提高了肠道的免疫水平,从而提高了断奶仔猪抵御大肠杆菌F18感染的能力。

香烟烟雾提取物对人支气管上皮细胞中LIGHT及其受体基因表达的影响

目的观察香烟烟雾提取物(CSE)对人支气管上皮细胞16HBE中肿瘤坏死因子超家族成员14(LIGHT)及其受体LTβR和HVEM基因表达的影响。方法将体外培养的16HBE细胞分为干预组和对照组,干预组分别加1%、2%、3%、4%、5%CSE培养48 h,或以3%CSE分别培养6、12、24、36、48 h;对照组加同样体积的无血清DMEM处理。收集对照组和干预组不同浓度和不同作用时点的细胞,采用real-time PCR法检测LIGHT、LTβR、HVEM mRNA。结果与对照组比较,干预组CSE作用16HBE细胞48 h后LIGHT LTβR mRNA表达升高,分别于3%~5%、2%~5%CSE时差异有统计学意义(P均<0.05);干预组1%~4%CSE作用16HBE细胞48 h后HVEM mRNA表达升高(P均<0.05),3%CSE时到达峰值,5%CSE时HVEM mRNA表达较对照组降低(P<0.05)。与对照组比较,3%CSE作用16HBE细胞后各时点LIGHT、LTβR mRNA表达逐渐升高,分别于36、48 h和24、36、48 h时差异有统计学意义(P均<0.05);3%CSE作用16HBE细胞48 h时HVEM mRNA表达升高(P<0.01),其余时点表达变化不显著。结论随着CSE浓度升高和作用时间延长,可引起16HBE细胞LIGHT、LTβR、HVEM基因表达的改变。