SV40LT基因重组腺病毒载体的包装、鉴定及用于转染日本血吸虫童虫细胞的研究

目的构建携带SV40LT基因的重组腺病毒表达载体,制备具有感染力的重组腺病毒,观察其转染日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)童虫细胞后的表达情况。方法采用体外连接法构建好的携带SV40LT基因的重组腺病毒质粒(AdHu5-SV40LT)转化Stbl2感受态菌,获得重组腺病毒质粒后,经Pac I酶切线性化后转染293A细胞,获得出重组腺病毒(AdHu5-SV40LT)。将重组腺病毒感染Sj童虫细胞,采用RT-PCR和免疫组织化学检测SV40LT基因的表达情况。结果重组腺病毒载体质粒可转染293A细胞并可在293A细胞内进行有效的复制;提取病毒DNA进行PCR检测证实含有SV40LT目的基因。以重组腺病毒能感染Sj童虫细胞,经RT-PCR和免疫组化检测有SV40LT基因在细胞中的表达。结论成功包装了具有感染能力的含SV40LT基因的重组腺病毒,感染Sj童虫细胞后目的基因有表达,为进一步探索日本血吸虫细胞永生化提供了实验依据。

应用大肠杆菌LT基因探针检测几种肠道菌LT的初步研究

为探讨肠毒原性大肠杆菌(ETEC)以外的肠道致病菌的不耐热肠毒素(LT)的情况,我们应用国内 LT 基因探针检测了志贺氏菌属等9种肠道菌共200株,并用健康人大肠杆菌102株作对照观察,现将结果报告如下。

实时荧光定量PCR检测感染小鼠肠道内容物的LT肠毒素基因

构建LT-PMD19质粒标准品,进行SYBR Green荧光定量PCR检测产肠毒素大肠杆菌(ETEC)LT基因,以确定该方法的特异性和灵敏度,绘制标准曲线;通过腹腔注射0.2mL ETEC菌液建立小鼠腹泻模型,分别于感染后4h、15h、2d、7d和14d各处死2只,通过建立的荧光定量PCR方法对小肠液中的ETEC的LT基因进行定量检测。研究结果显示,用建立的荧光定量PCR检测LT基因无非特异性扩增,标准曲线呈良好的线性关系(R2=0.999),标准品的熔解曲线均呈单峰,灵敏度为8.18×103拷贝数/μL;小鼠感染4h后LT毒素含量最高,剖检可见小肠肿大,充满黄绿色的内容物,感染后7d、14d均未检测出LT毒素,肠道未见明显病变,表明LT肠毒素在肠道内的生成规律与肠道病变损伤呈正相关。

带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体的构建(英文)

目的 构建带有SV4 0LT抗原基因的逆转录病毒载体。方法 采用体外重组技术构建带SV4 0LT抗原基因的逆转录病毒载体 ,酶切、测序进行鉴定 ,脂质体介导转染PA317包装细胞 ,经G4 18筛选出抗性克隆 ,通过NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果 酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV4 0LT抗原基因 ,且为正向插入。NIH3T3细胞测定病毒滴度为 1.3× 10 6CFU/ml。结论 成功构建了含SV4 0LT抗原基因的逆转录病毒载体并包装出了高滴度的假病毒颗粒。

大肠杆菌热敏毒素LT克隆基因的PCR定点诱变和重组表达的构建

为使大肠杆菌热敏毒素LT的毒素活性丧失的同时仍保留其较强的免疫原性 ,实验依据LT基因的同源序列设计并合成 5条引物 ,采用突出末端PCR法和重组PCR法 ,将克隆于质粒pEWD2 99上的LT基因 ,分别引入BamHI、Ndel和xhol等位点 ,扩增出带有上述RE位点且含有m7和m112 突变点的约 110 0bp和约 80 0bp的DNA片段和不含突变点的约 30 0bp的DNA片段 ,使控制LT毒力活性中心的第 7位和第 112位氨基酸的碱基分别发生诱变 ,各DNA片段经分离、纯化、RE酶切和DNA连接酶连接后 ,插入经BamHI和Xhol双酶切的线性化的高效表达载体pGEX_4T_1的多克隆位点区 ,使LTm基因置于pTac强启动子下且与Thrombin蛋白基因融合表达 ,将连接产物转化入JM10 5菌株 ,挑出可疑阳性菌落 ,提取质粒 ,经酶切鉴定、PCR鉴定和DNA序列分析 ,证明读框正确 ,序列正确 ,获得了pGEX_4T_1(LTm7和pGEX_4T_1(LTm112 两个重组表达质粒。为运用基因工程手段大量生产人和动物大肠杆菌流行性腹泻的疫苗抗原和幽门螺杆菌疫苗的粘膜免疫佐剂 ,完成了基因水平的工作。

SV40LT抗原基因逆转录病毒载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的 构建含SV 40LT抗原基因的逆转录病毒载体并转染鼠肝细胞 ,检测SV 40LT抗原基因在肝细胞中的表达情况 ,为肝细胞移植研究打下基础。方法 利用体外基因重组技术构建含SV 40LT抗原基因的逆转录病毒载体并酶切、测序鉴定 ,脂质体介导转染PA3 17细胞 ,G 418抗性筛选阳性克隆 ,通过NIH 3T3细胞测定病毒滴度 ;分离、纯化大鼠肝细胞后 ,将含SV 40LT抗原基因的假病毒颗粒感染肝细胞 ,用PCR及免疫组化法检测转染肝细胞中SV40LT抗原基因的表达情况。结果 ( 1)酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV 40LT抗原基因 ;( 2 )病毒滴度为 1.3× 10 6 cfu/ml ;( 3 )转染后的肝细胞含有SV40LT抗原基因 ,其表达在转染后 2 4h明显高于 96h(P <0 .0 5 )。结论 成功构建含SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体 ,转染后的肝细胞表达有目的基因 。

猪LTβR基因克隆、结构功能预测、组织表达谱分析及真核表达载体构建

为了进一步探究猪LTβR基因的生物学功能,本研究以猪淋巴组织cDNA为模板扩增LTβR基因CDS区,进一步利用生物信息学对猪LTβR蛋白结构与功能以及参与的GO和Pathway通路进行分析,利用Real-time PCR检测LTβR基因在大白猪不同组织中的表达水平,同时将LTβR基因扩增产物克隆至真核表达载体pEGFPC1中,并分别转染猪HEK293和IPEC-J2小肠上皮细胞系,通过显微镜观察其表达情况。结果表明,克隆获得猪LTβR基因CDS区全长为1 209bp,编码402个氨基酸,发现LTβR为脂溶亲水性的不稳定蛋白,存在1个跨膜结构(205~227aa),不存在信号肽,亚细胞定位表明LTβR为非分泌型蛋白。LTβR蛋白具有2个糖基化位点,18个潜在的磷酸化位点,其中包括PKC、CKI、CDC2、GSK3、CDK5、INSR等10种保守的特异性蛋白质激酶的结合位点。该蛋白保守区域为2个TNFR superfamily,分别位于32~125和128~192位氨基酸,并发现C422T>A141V突变位于该区域内。KEGG和GO分析发现,LTβR基因共参与12项GO功能分类,同时还参与NF-kappa B信号通路、IgA合成的肠道免疫网络等5项调控通路。定量检测发现,LTβR基因在大白猪肺中的表达水平极显著高于其他组织(P<0.01),在肾和脾等免疫器官,十二指肠和空肠等肠道组织中也均有较高的表达水平。细胞水平转染试验及显微镜观察发现其在猪HEK293和IPEC-J2两种细胞中均表达。本研究为猪LTβR基因及其介导的信号通路的功能分析提供了材料和依据,今后有必要在细胞水平上进一步验证分析猪LTβR基因及其介导的信号通路在猪抵抗细菌感染过程中发挥的重要作用,同时将C422T突变作为猪抗病育种的一个潜在遗传标记进行系统分析。

鸡致病性大肠杆菌肠毒素(LT)的鉴定及其基因的克隆

鸡致病性大肠杆菌分离株O78经家兔肠袢结扎试验(RILT)证实,该菌株产生热敏性肠毒素(LT)。用PCR技术从该菌株中扩增出1.2kb的LT基因,然后将纯化的PCR产物克隆到pGEM-T载体中,转化至受体菌JM109中。用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选得到阳性重组菌株,提取质粒用SphI和SalI双酶切鉴定,结果证实,构建的克隆质粒pXCLT1含有LT基因。

生物素标记LT基因探针检测产肠毒素性大肠杆菌

用碱变性法提取重组质粒pEWD299,经Hind Ⅲ酶切后,进行琼脂糖凝胶电泳,用电洗脱法回收LT基因850bp的核酸片段,再用二步法缺口翻译反应制备生物素标记的LT基因探针.通过菌落杂交试验表明,在严格去蛋白和RNA的条件下,该探针与试验中所有产LT和ST,或仅产LT的ETEC发生杂交反应;而与所有仅产ST的ETEC、侵袭性大肠杆菌(EIEC)、普通大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠耶尔森氏菌、霍乱弧菌均无杂交反应.其检测提纯的LT—DNA的敏感性水平为25pg,检测食品模拟标本中产LT大肠杆菌的敏感性达到130个细菌/g的水平.

不同日龄苏太仔猪LTβR基因组织表达谱及发育性表达规律分析

试验旨在探讨LTβR基因在仔猪出生至断奶期间的mRNA表达变化,为进一步研究该基因与F18大肠杆菌致病的相关性提供理论依据。本试验选取从初生到断奶的4个日龄(8、18、30和35日龄)苏太仔猪各4头,利用实时荧光定量PCR方法分别比较分析了LTβR基因在各个体11个组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肌肉、胸腺、淋巴结、十二指肠及空肠)间的表达规律。结果表明,LTβR基因在肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、淋巴结、十二指肠及空肠组织中呈现较高水平的表达,并且表现出明显的发育性表达差异。LTβR基因在8日龄仔猪淋巴、十二指肠和空肠组织中的表达极显著高于其他日龄(P<0.01);在8日龄仔猪肺脏组织中的表达极显著高于35日龄(P<0.01),且显著高于30日龄(P<0.05);在35日龄仔猪肝脏组织中的表达极显著高于其他日龄(P<0.01);在35日龄仔猪胃组织中的表达显著高于18日龄(P<0.05)。由此推测,8日龄左右为仔猪肠道免疫屏障快速形成期,LTβR基因的较高表达可能有利于仔猪对F18大肠杆菌抗性。

猪大肠埃希菌肠毒素基因的多重PCR检测

以产肠毒素性大肠埃希菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)耐热肠毒素(STa、STb)基因和不耐热肠毒素(LT)基因保守序列为靶序列,设计合成了3对可扩增目的片段为182、108和336 bp的引物,建立了检测ETEC耐热肠毒素基因和不耐热肠毒素基因的多重PCR方法.该方法对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)EDL933、猪链球菌Streptcoccus、鼠伤寒沙门氏杆菌Salmonella typhimrium和猪肺疫巴氏杆菌Pasteurella pneumotropic的检测结果均为阴性,并且能检测到102cfu/mL稀释度的标准菌.对11株分离自广东佛山地区腹泻仔猪的待检菌株进行检测,结果为:含STa基因的菌株为5株;含STb基因为2株;含LT基因为3株,其中2株同时具有STb和LT基因.结果表明:该方法的特异性和敏感性较高,可用于ETEC的临床快速诊断和流行病学调查.

猪大肠杆菌不耐热肠毒素基因的PCR检测

以产肠毒素性大肠埃希氏菌(ETEC)不耐热肠毒素(LT)保守序列为靶序列,设计合成了一对可扩增336 bp目的片段的引物,建立了检测ETEC不耐热肠毒素(LT)基因的PCR方法。该方法对987p+、鼠伤寒沙门氏杆菌、猪肺疫巴氏杆菌和链球菌的检测结果均为阴性。对15株分离自腹泻仔猪的待检菌株进行检测,有3株LT基因阳性。结果表明:该方法的特异性和敏感性较高,可用于ETEC的临床快速诊断和流行病学调查。

香烟烟雾提取物对人支气管上皮细胞中LIGHT及其受体基因表达的影响

目的观察香烟烟雾提取物(CSE)对人支气管上皮细胞16HBE中肿瘤坏死因子超家族成员14(LIGHT)及其受体LTβR和HVEM基因表达的影响。方法将体外培养的16HBE细胞分为干预组和对照组,干预组分别加1%、2%、3%、4%、5%CSE培养48 h,或以3%CSE分别培养6、12、24、36、48 h;对照组加同样体积的无血清DMEM处理。收集对照组和干预组不同浓度和不同作用时点的细胞,采用real-time PCR法检测LIGHT、LTβR、HVEM mRNA。结果与对照组比较,干预组CSE作用16HBE细胞48 h后LIGHT LTβR mRNA表达升高,分别于3%~5%、2%~5%CSE时差异有统计学意义(P均<0.05);干预组1%~4%CSE作用16HBE细胞48 h后HVEM mRNA表达升高(P均<0.05),3%CSE时到达峰值,5%CSE时HVEM mRNA表达较对照组降低(P<0.05)。与对照组比较,3%CSE作用16HBE细胞后各时点LIGHT、LTβR mRNA表达逐渐升高,分别于36、48 h和24、36、48 h时差异有统计学意义(P均<0.05);3%CSE作用16HBE细胞48 h时HVEM mRNA表达升高(P<0.01),其余时点表达变化不显著。结论随着CSE浓度升高和作用时间延长,可引起16HBE细胞LIGHT、LTβR、HVEM基因表达的改变。

哺乳动物睾丸细胞株的建立及应用

哺乳动物生精过程是一个精细的调节过程 ,人们对于这个过程还了解甚少。这主要是由于维持生殖细胞体外培养的必需条件尚未建立 ,睾丸生精细胞可原代培养的时间太短。因此 ,有必要建立能在体外长期传代的睾丸生精细胞株。Hofmann等人用磷酸钙法将猴病毒 40大T抗原 (sv40lt)基因掺入小鼠睾丸细胞建立了永生的睾丸细胞株 ,并利用这些细胞株研究了睾丸特异基因的表达。随后 ,又通过对小鼠睾丸生精细胞共转染sv40lt基因和编码温度敏感p5 3蛋白基因 ,建立了两个能在体外继续分化的生精细胞株。这些睾丸细胞株的建立为精子发生研究提供了一个有用的实验模型。

LTβR基因在大肠杆菌F18抗性型和敏感型苏太仔猪间的差异表达分析

旨在探讨LTβR基因在苏太断奶仔猪各组织间的mRNA表达谱,并比较分析该基因在大肠杆菌F18抗性/敏感型群体间的表达差异,为进一步探讨该基因的功能及筛选断奶仔猪大肠杆菌F18抗性遗传标记提供一定的指导和依据。试验分别挑选35日龄大肠杆菌F18抗性/敏感型苏太断奶仔猪各4头,利用实时荧光定量PCR方法比较分析LTβR基因在11个组织(心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、胸腺、淋巴结、十二指肠、空肠)间的表达差异。结果:LTβR基因在检测的11个组织中均有表达,其中在肝、肺、肾、胃、十二指肠和空肠呈现高水平表达,在脾和淋巴结中呈现中等水平表达,在心脏、肌肉和胸腺组织中呈现低水平表达。除肝脏外,LTβR基因在抗性型个体中表达量普遍高于敏感型个体,而且在肠系膜淋巴结中的表达量极显著高于敏感型个体(P<0.01)。由此推测,LTβR基因的表达上调有利于断奶仔猪抵御大肠杆菌F18的感染,且可能是通过在淋巴结组织中的高表达维持和提高了肠道的免疫水平,从而提高了断奶仔猪抵御大肠杆菌F18感染的能力。

产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌多重荧光定量PCR方法的建立及应用

为了建立能同时检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的多重荧光定量PCR方法,试验根据GenBank中产肠毒素大肠杆菌ST和LT基因及沙门氏菌invA基因序列设计引物和探针,通过优化扩增体系中引物和探针剂量建立检测产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的多重荧光定量PCR方法,分析该方法的特异性、敏感性和重复性,用建立的方法对85份临床样品进行检测,并与实验室传统血清学分离鉴定方法进行比较。结果表明:在ST基因的最佳引物和探针剂量为0.4μL、0.8μL,LT基因的最佳引物和探针剂量为0.6μL、1.0μL,invA基因的最佳引物和探针剂量为1.0μL、1.2μL时,扩增曲线良好,ST基因、LT基因、invA基因的标准曲线回归方程相关系数(R2)分别为0.975,0.968,0.915,扩增曲线具有良好线性关系;建立的多重荧光定量方法对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等细菌核酸无交叉反应;组内重复变异系数均低于2%,且产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的最低检出浓度均为1×10^(1)copies/μL;从85份临床样品中检出产肠毒素大肠杆菌20份,沙门氏菌阳性样品10份,双阳性样品2份,与实验室传统血清学分离鉴定方法的符合率为94.12%。说明试验建立的多重荧光定量PCR方法的特异性好、敏感性强,稳定性高,具有良好的使用前景。

产肠毒性大肠杆菌DPO-PCR检测方法的建立与应用

双启动寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide，DPO）是一种新型的引物设计方法，具有设计简易、特异性强以及退火温度范围宽的特点。以产肠毒性大肠杆菌LT基因为靶基因，设计了一对DPO引物，经过对TaqDNA聚合酶、Mg2＋、dNTP反应体系因子的优化，建立了产肠毒性大肠杆菌DPO-PCR检测方法，测定了该方法的灵敏度、特异性以及退火温度不敏感性。结果显示，该方法检测灵敏度为1．24×10^2CFU／ml，在45℃～65℃退火温度范围内，均可实现靶基因的高效扩增。该方法特异性强，测试菌株中4株产肠毒性大肠杆菌均为阳性结果，其余菌株为阴性结果，且无非特异性扩增发生。与常规PCR方法相比，DPO—PCR方法不需要对引物参数特别是退火温度反复优化，同时DPO引物的特殊结构又增强了检测特异性，为致病性微生物的快速准确检测提供了新方法。

LAMP技术检测食品中产肠毒素大肠埃希氏菌

产肠毒素大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是一种重要的引起人畜共患病的致病菌,能引起水样便及酸中毒,建立快速、准确的检测方法对预防和控制产肠毒素大肠埃希氏菌的感染具有重要意义。基于ETEC不耐热肠毒素LT基因序列,设计LAMP引物检测产肠毒素大肠埃希氏菌。结果表明:LAMP检测产肠毒素大肠埃希氏菌的检出限为32.9cfu/mL,人工污染生猪肉的检出限为55cfu/g。LAMP将可以成为替代PCR的核酸扩增新技术,为快速检测产肠毒素大肠埃希氏菌构建了一个技术平台。