产肠毒素大肠杆菌K88-STII-LTA2/LTB融合基因在烟草中的表达

融合保护性抗原的LT类全毒素具有传输抗原载体和免疫佐剂两重功效。利用基因工程技术,构建了带有信号肽的Pr1as-K88ac-STII-LTA 2/UP-LTB融合基因的双价植物表达载体。双价植物表达载体通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101,并利用农杆菌介导技术叶盘法转化模式植物烟草。转基因烟草经PCR和RT-PCR初步检测,证明外源基因已经整合到受体植物基因组中,同时表明融合基因在转录水平上有表达。转基因烟草的获得,为进一步研制新型的抗腹泻植物口服疫苗奠定了良好的基础。

SV40LT基因重组腺病毒载体的包装、鉴定及用于转染日本血吸虫童虫细胞的研究

目的构建携带SV40LT基因的重组腺病毒表达载体,制备具有感染力的重组腺病毒,观察其转染日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)童虫细胞后的表达情况。方法采用体外连接法构建好的携带SV40LT基因的重组腺病毒质粒(AdHu5-SV40LT)转化Stbl2感受态菌,获得重组腺病毒质粒后,经Pac I酶切线性化后转染293A细胞,获得出重组腺病毒(AdHu5-SV40LT)。将重组腺病毒感染Sj童虫细胞,采用RT-PCR和免疫组织化学检测SV40LT基因的表达情况。结果重组腺病毒载体质粒可转染293A细胞并可在293A细胞内进行有效的复制;提取病毒DNA进行PCR检测证实含有SV40LT目的基因。以重组腺病毒能感染Sj童虫细胞,经RT-PCR和免疫组化检测有SV40LT基因在细胞中的表达。结论成功包装了具有感染能力的含SV40LT基因的重组腺病毒,感染Sj童虫细胞后目的基因有表达,为进一步探索日本血吸虫细胞永生化提供了实验依据。

大肠杆菌热敏毒素LT克隆基因的PCR定点诱变和重组表达的构建

为使大肠杆菌热敏毒素LT的毒素活性丧失的同时仍保留其较强的免疫原性 ,实验依据LT基因的同源序列设计并合成 5条引物 ,采用突出末端PCR法和重组PCR法 ,将克隆于质粒pEWD2 99上的LT基因 ,分别引入BamHI、Ndel和xhol等位点 ,扩增出带有上述RE位点且含有m7和m112 突变点的约 110 0bp和约 80 0bp的DNA片段和不含突变点的约 30 0bp的DNA片段 ,使控制LT毒力活性中心的第 7位和第 112位氨基酸的碱基分别发生诱变 ,各DNA片段经分离、纯化、RE酶切和DNA连接酶连接后 ,插入经BamHI和Xhol双酶切的线性化的高效表达载体pGEX_4T_1的多克隆位点区 ,使LTm基因置于pTac强启动子下且与Thrombin蛋白基因融合表达 ,将连接产物转化入JM10 5菌株 ,挑出可疑阳性菌落 ,提取质粒 ,经酶切鉴定、PCR鉴定和DNA序列分析 ,证明读框正确 ,序列正确 ,获得了pGEX_4T_1(LTm7和pGEX_4T_1(LTm112 两个重组表达质粒。为运用基因工程手段大量生产人和动物大肠杆菌流行性腹泻的疫苗抗原和幽门螺杆菌疫苗的粘膜免疫佐剂 ,完成了基因水平的工作。

带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体的构建(英文)

目的 构建带有SV4 0LT抗原基因的逆转录病毒载体。方法 采用体外重组技术构建带SV4 0LT抗原基因的逆转录病毒载体 ,酶切、测序进行鉴定 ,脂质体介导转染PA317包装细胞 ,经G4 18筛选出抗性克隆 ,通过NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果 酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV4 0LT抗原基因 ,且为正向插入。NIH3T3细胞测定病毒滴度为 1.3× 10 6CFU/ml。结论 成功构建了含SV4 0LT抗原基因的逆转录病毒载体并包装出了高滴度的假病毒颗粒。

大肠杆菌生物素LT基因探针的制备及应用

碱变性和羟基磷灰石柱层析分离纯化大肠杆菌重组质粒ＰＷＪ１４０ＤＮＡ，经ＰＳＴＩ完全酶解，琼脂糖凝胶电泳分离，电洗脱回收５．９ｋｂ片段，经化学修饰转氨基作用后制成ＬＴ基因的生物素探针，斑点印迹杂交试验表明，生物素ＬＴ基因探针灵敏性高，可检测到ｐｇ水平，与标准的ＥＴＥＣ（ＬＴ＋）杂交阳性，与非ＥＴＥＣ的大肠杆菌、沙门氏菌等无杂交反应。２０份不同来源的样品试验结果表明，ＬＴ探针可用于检测猪、牛、人、鸡及食品来源的毒素源性大肠杆菌。

SV40LT抗原基因逆转录病毒载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的 构建含SV 40LT抗原基因的逆转录病毒载体并转染鼠肝细胞 ,检测SV 40LT抗原基因在肝细胞中的表达情况 ,为肝细胞移植研究打下基础。方法 利用体外基因重组技术构建含SV 40LT抗原基因的逆转录病毒载体并酶切、测序鉴定 ,脂质体介导转染PA3 17细胞 ,G 418抗性筛选阳性克隆 ,通过NIH 3T3细胞测定病毒滴度 ;分离、纯化大鼠肝细胞后 ,将含SV 40LT抗原基因的假病毒颗粒感染肝细胞 ,用PCR及免疫组化法检测转染肝细胞中SV40LT抗原基因的表达情况。结果 ( 1)酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV 40LT抗原基因 ;( 2 )病毒滴度为 1.3× 10 6 cfu/ml ;( 3 )转染后的肝细胞含有SV40LT抗原基因 ,其表达在转染后 2 4h明显高于 96h(P <0 .0 5 )。结论 成功构建含SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体 ,转染后的肝细胞表达有目的基因 。

猪LTβR基因克隆、结构功能预测、组织表达谱分析及真核表达载体构建

为了进一步探究猪LTβR基因的生物学功能,本研究以猪淋巴组织cDNA为模板扩增LTβR基因CDS区,进一步利用生物信息学对猪LTβR蛋白结构与功能以及参与的GO和Pathway通路进行分析,利用Real-time PCR检测LTβR基因在大白猪不同组织中的表达水平,同时将LTβR基因扩增产物克隆至真核表达载体pEGFPC1中,并分别转染猪HEK293和IPEC-J2小肠上皮细胞系,通过显微镜观察其表达情况。结果表明,克隆获得猪LTβR基因CDS区全长为1 209bp,编码402个氨基酸,发现LTβR为脂溶亲水性的不稳定蛋白,存在1个跨膜结构(205~227aa),不存在信号肽,亚细胞定位表明LTβR为非分泌型蛋白。LTβR蛋白具有2个糖基化位点,18个潜在的磷酸化位点,其中包括PKC、CKI、CDC2、GSK3、CDK5、INSR等10种保守的特异性蛋白质激酶的结合位点。该蛋白保守区域为2个TNFR superfamily,分别位于32~125和128~192位氨基酸,并发现C422T>A141V突变位于该区域内。KEGG和GO分析发现,LTβR基因共参与12项GO功能分类,同时还参与NF-kappa B信号通路、IgA合成的肠道免疫网络等5项调控通路。定量检测发现,LTβR基因在大白猪肺中的表达水平极显著高于其他组织(P<0.01),在肾和脾等免疫器官,十二指肠和空肠等肠道组织中也均有较高的表达水平。细胞水平转染试验及显微镜观察发现其在猪HEK293和IPEC-J2两种细胞中均表达。本研究为猪LTβR基因及其介导的信号通路的功能分析提供了材料和依据,今后有必要在细胞水平上进一步验证分析猪LTβR基因及其介导的信号通路在猪抵抗细菌感染过程中发挥的重要作用,同时将C422T突变作为猪抗病育种的一个潜在遗传标记进行系统分析。

实时荧光定量PCR检测感染小鼠肠道内容物的LT肠毒素基因

构建LT-PMD19质粒标准品,进行SYBR Green荧光定量PCR检测产肠毒素大肠杆菌(ETEC)LT基因,以确定该方法的特异性和灵敏度,绘制标准曲线;通过腹腔注射0.2mL ETEC菌液建立小鼠腹泻模型,分别于感染后4h、15h、2d、7d和14d各处死2只,通过建立的荧光定量PCR方法对小肠液中的ETEC的LT基因进行定量检测。研究结果显示,用建立的荧光定量PCR检测LT基因无非特异性扩增,标准曲线呈良好的线性关系(R2=0.999),标准品的熔解曲线均呈单峰,灵敏度为8.18×103拷贝数/μL;小鼠感染4h后LT毒素含量最高,剖检可见小肠肿大,充满黄绿色的内容物,感染后7d、14d均未检测出LT毒素,肠道未见明显病变,表明LT肠毒素在肠道内的生成规律与肠道病变损伤呈正相关。

平板免疫溶血与基因探针试验检测ETEC中LT的比较研究

产毒性大肠杆菌(ETEC)是人和家畜感染性腹泻的重要病原菌。它产生两种肠毒素:热稳定肠毒素(ST)和热敏感肠毒素(LT)。后者有多种检测方法,包括经典的兔肠结扎、组织培养、皮肤试验以及近来的 SPA 协同凝集法,固相放射免疫、ELISA 等。国内学者杨氏根据 Evans 的被动免疫溶血试验原理结合自己的实际工作创建了平板免疫溶血试验(PIHT),取得了较好的效果。但该法需高质量的特异性抗体,最近北京302医院制备 LT-McAb。

大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)基因探针检测霍乱弧菌(Vc)的实验研究

自六十年代初霍乱第七次世界大流行以来,检测方法发展很快,种类繁多,但都属表型(Phenotype)检测范畴,常会受到影响抗原。

不同日龄苏太仔猪LTβR基因组织表达谱及发育性表达规律分析

试验旨在探讨LTβR基因在仔猪出生至断奶期间的mRNA表达变化,为进一步研究该基因与F18大肠杆菌致病的相关性提供理论依据。本试验选取从初生到断奶的4个日龄(8、18、30和35日龄)苏太仔猪各4头,利用实时荧光定量PCR方法分别比较分析了LTβR基因在各个体11个组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肌肉、胸腺、淋巴结、十二指肠及空肠)间的表达规律。结果表明,LTβR基因在肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、淋巴结、十二指肠及空肠组织中呈现较高水平的表达,并且表现出明显的发育性表达差异。LTβR基因在8日龄仔猪淋巴、十二指肠和空肠组织中的表达极显著高于其他日龄(P<0.01);在8日龄仔猪肺脏组织中的表达极显著高于35日龄(P<0.01),且显著高于30日龄(P<0.05);在35日龄仔猪肝脏组织中的表达极显著高于其他日龄(P<0.01);在35日龄仔猪胃组织中的表达显著高于18日龄(P<0.05)。由此推测,8日龄左右为仔猪肠道免疫屏障快速形成期,LTβR基因的较高表达可能有利于仔猪对F18大肠杆菌抗性。

多重DPO-PCR检测转基因玉米MON810和MIR604体系建立

针对转基因玉米MON810和MIR604品系插入位点序列,分别设计品系特异性DPO引物,建立转基因玉米MON810和MIR604品系检测的多重DPO-PCR方法。结果表明,设计的DPO引物特异性强,灵敏度达0.5 ng/μL,并且对退火温度不敏感。该检测方法特异性强、灵敏度高,适合于对转基因玉米MON810和MIR604品系进行快速检测。

鸡致病性大肠杆菌肠毒素(LT)的鉴定及其基因的克隆

鸡致病性大肠杆菌分离株O78经家兔肠袢结扎试验(RILT)证实,该菌株产生热敏性肠毒素(LT)。用PCR技术从该菌株中扩增出1.2kb的LT基因,然后将纯化的PCR产物克隆到pGEM-T载体中,转化至受体菌JM109中。用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选得到阳性重组菌株,提取质粒用SphI和SalI双酶切鉴定,结果证实,构建的克隆质粒pXCLT1含有LT基因。

应用大肠杆菌LT基因探针检测几种肠道菌LT的初步研究

为探讨肠毒原性大肠杆菌(ETEC)以外的肠道致病菌的不耐热肠毒素(LT)的情况,我们应用国内 LT 基因探针检测了志贺氏菌属等9种肠道菌共200株,并用健康人大肠杆菌102株作对照观察,现将结果报告如下。

金黄色葡萄球菌DPO-PCR快速检测方法的建立与应用

为建立检测金黄色葡萄球菌（SA）的PCR方法,以SA Sa442基因为靶基因设计了一对双启动寡核苷酸引物（DPO）,建立了SA的DPO-PCR快速检测方法。结果显示,在45~65℃退火温度范围内均能高效地扩增出目的基因,表明DPO引物对退火温度不敏感,该方法的灵敏度为2.27×102cfu/m L,同时DPO引物特异性强,与其他菌株无非特异性扩增反应。利用该方法和行标法分别对采集的175份样品进行检测,均共计检出13份SA阳性样品,两者符合率为100%。作者建立的DPO-PCR方法设计简单、特异性强,具有良好的实用性,为快速准确检测SA提供新的检测手段。

肠致病性大肠杆菌DPO-PCR快速检测方法的建立

为建立肠致病性大肠杆菌（EPEC）的快速检测方法,本研究以EPEC bfp A基因为靶基因设计了一对双启动寡核苷酸引物（DPO）,建立了EPEC的DPO-PCR快速检测方法。结果显示,退火温度在45℃~65℃范围内均能够高效地扩增出目的基因,表明DPO引物对退火温度不敏感。该方法对其他菌株的扩增结果均为阴性,特异性强;其灵敏度为97 cfu/m L。利用该方法和国标法分别对采集的230份临床样品进行检测,均共计检出5份EPEC阳性样品,两者符合率为100%。本研究建立的DPO-PCR方法设计简单、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性,为快速准确检测EPEC提供新的检测手段。

弗劳地枸橼酸盐杆菌基因种与小儿腹泻关系、耐药性的研究

从1457例腹泻患儿大便中分离出164株(11.25%)弗劳地枸橼酸盐杆菌复合群的菌株,而对照组中分离率仅4.26%,具统计学差异(P<0.05)。为探讨其致病性,采用不耐热性肠毒素(LT)、耐热性肠毒素(ST)基因探针,菌液直接LT-PCR,家兔肠袢结扎和刚果红结合试验检测细菌的腹泻毒力因子,证实47.1%的菌株产生LT,系腹泻重要毒力因子,不具侵袭性因子。LT阳性菌株见于C.freundii,C.braakii,C.werkmanii。初步认为弗劳地枸橼酸盐杆菌与小儿腹泻密切相关,耐药性检测表明10%的菌株产生超广谱β-内酰胺酶。

副溶血弧菌DPO-PCR检测方法的建立

以副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,VP）toxR基因为靶基因设计了一对双启动寡核苷酸（DPO）引物,建立了DPO-PCR快速检测VP的方法.结果显示,退火温度在49～69℃都能有效地扩增出目的基因,表明该检测方法对退火温度不敏感;该DPO引物仅与VP的扩增反应呈阳性,而与其他菌株无非特异性扩增反应,表明该方法特异性强;该方法的灵敏度为121 CFU/mL.利用该检测方法对采集的550份样品进行检测,共计检出19份VP阳性样品,与行标法（SN/T 1870-2007）检测结果一致,实用性良好.该DPO-PCR方法设计简单、特异性强,具有良好的实用性.

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌LT2的(Salmonella enterica serovar typhimurium LT2,S.typhimurium LT2)sopB基因。以pKD4质粒为模板,扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59 bp分别与sopB基因上下游序列同源的同源打靶片段,将其转化至表达Red重组酶的S.typhimurium LT2感受态细胞中;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,同源片段和菌体sopB基因发生同源重组,通过卡那霉素筛选得到带有抗性标记的阳性重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以除去抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;利用PCR技术鉴定重组菌,并通过检测沙门氏菌效应蛋白SopB的分泌以及沙门氏菌感染HeLa细胞后pAKT的激活反应来鉴定sopB基因是否被敲除。构建的ΔsopB突变菌株失去了分泌SopB蛋白的能力,且不能够像野生型菌株那样在感染HeLa细胞的过程中激活pAkt。本研究获得了S.typhimurium LT2的sopB基因缺失突变株,为沙门氏菌感染宿主过程中SopB的功能研究提供工具,同时也为进一步探索其他类型细菌的基因敲除提供了线索。

肠侵袭性大肠杆菌DPO-PCR检测方法的建立与应用

目的为建立肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）的DPO-PCR快速检测方法。方法本研究以EIECipaH基因为靶基因设计了一对双启动寡核苷酸（DPO）引物,建立了EIEC DPO-PCR检测方法。结果退火温度范围在47℃~67℃内都能有效地扩增出目的基因,表明该检测方法对退火温度不敏感;该DPO引物仅与EIEC的扩增反应呈阳性,而与其他菌株无非特异性扩增反应,表明该方法特异性强;该方法的灵敏度为1.17×102 cfu/mL。利用该检测方法对采集的230份样品进行检测,共计检出3份EIEC阳性样品,与国标法（GB 4789.6-2003）检测结果一致,显示了良好的实用性。结论该DPO-PCR方法设计简单、特异性强,具有良好的实用性。