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大肠杆菌不耐热肠毒素LTB大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体的构建及表达
1
作者 刘琼 王春凤 +2 位作者 尚晓敏 李桂玲 李皓 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第10期184-186,共3页
为了获取大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因,试验以产肠毒素大肠杆菌的大质粒为模板,采用PCR技术扩增大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因,并将PCR产物克隆至p MD18-T载体中构建克隆质粒p MD18T-LTB;通过酶切、纯化将LTB基因与大肠杆菌-乳酸菌穿梭... 为了获取大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因,试验以产肠毒素大肠杆菌的大质粒为模板,采用PCR技术扩增大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因,并将PCR产物克隆至p MD18-T载体中构建克隆质粒p MD18T-LTB;通过酶切、纯化将LTB基因与大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体p W425et连接构建成重组质粒p W425et-LTB,将p W425et-LTB转化至thy A基因缺陷型大肠杆菌X13感受态细胞中,再进行SDS-PAGE、Western-blot检测。结果表明:重组大肠杆菌表达出LTB蛋白,且表达的融合蛋白能被LTB特异性抗体识别。 展开更多
关键词 大肠杆菌 不耐热肠毒素ltb 乳酸菌 表达载体 构建 表达
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大肠杆菌肠毒素ST_1-LT_B融合基因表达条件的优化
2
作者 朱舟 万军飞 +4 位作者 高铭鸿 孔庆斌 刘雪霞 高凤山 许崇波 《生物技术》 CAS CSCD 2007年第4期34-38,共5页
目的:对已构建的含有大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因的重组菌株进行鉴定和表达条件优化。方法:采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含ST1-LTB融合基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下ST1-LTB融合基因的表达情况。结果:酶切鉴定证实... 目的:对已构建的含有大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因的重组菌株进行鉴定和表达条件优化。方法:采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含ST1-LTB融合基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下ST1-LTB融合基因的表达情况。结果:酶切鉴定证实重组质粒pXSL1含有ST1-LTB融合基因且阅读框架正确,以IPTG为诱导剂诱导ST1-LTB融合基因表达的优化条件是:培养基pH7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时ST1-LTB融合蛋白表达量达35.2%。结论:实现ST1-LTB融合基因的高效表达,为大肠杆菌肠毒素双价基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的实验数据。 展开更多
关键词 大肠杆菌 ST1肠毒素 ltb肠毒素 融合基因 基因表达
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大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在毕赤酵母中的表达及鉴定 被引量:7
3
作者 陈明 李超 +7 位作者 王瑞 王秋华 黄婷 雷爱莹 陈福艳 甘西 余晓丽 梁万文 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第6期2093-2097,共5页
为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核... 为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核表达载体pPIC9K-LTB;重组质粒经核苷酸测序确认并线性化后电转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选转化子,并以小量诱导表达筛选高效表达工程菌株,最后Western blotting分析甲醇诱导上清中的LTB及采用亲和层析和HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化蛋白。结果表明,PCR克隆获得的LTB编码DNA序列与GenBank登录DNA序列完全一致,定向插入pPIC9K载体,可获得表达LTB的酵母分泌表达载体pPIC9K-LTB;电转化后的重组酵母菌KM71诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,发现甲醇诱导的培养基上清中含LTB,且具有较好的免疫原性。 展开更多
关键词 大肠杆菌肠毒素B亚单位(ltb) 基因表达 毕赤酵母 粘膜免疫佐剂
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大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位与产气荚膜梭菌β_1、β_2毒素融合基因的构建及表达 被引量:1
4
作者 曾瑾 邓光存 +3 位作者 陈耀光 张思浓 张玉婷 王玉炯 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第9期21-23,共3页
为了构建含大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)与产气荚膜梭菌β1、β2毒素融合基因的表达菌株,试验将亚克隆LTB基因融合到β2-β1毒素基因的上游,构建了pET30a-LTB-β2-β1原核表达载体,经IPTG诱导表达,对其表达产物进行SDS-PAGE检测和W... 为了构建含大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)与产气荚膜梭菌β1、β2毒素融合基因的表达菌株,试验将亚克隆LTB基因融合到β2-β1毒素基因的上游,构建了pET30a-LTB-β2-β1原核表达载体,经IPTG诱导表达,对其表达产物进行SDS-PAGE检测和Western-blot分析。结果表明:重组菌株可以表达LTB-β2-β1融合蛋白,且该融合蛋白可以被相应的抗体识别。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌 毒素 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(ltb) 融合基因
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猪圆环病毒2型Cap蛋白部分基因序列与大肠杆菌LTB成熟肽基因的融合表达及免疫原性研究 被引量:4
5
作者 侯强红 余兴龙 +5 位作者 李微 李润成 罗维 刘浩 尹恒 刘忠华 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期847-851,共5页
为了获得猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)衣壳蛋白(Cap)基因3’端396 bp的片段与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)成熟肽编码区融合基因的高效表达,并检验重组蛋白的免疫保护效果。以含PCV-2全基因组的pMDT PCV-2质粒... 为了获得猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)衣壳蛋白(Cap)基因3’端396 bp的片段与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)成熟肽编码区融合基因的高效表达,并检验重组蛋白的免疫保护效果。以含PCV-2全基因组的pMDT PCV-2质粒为模板,用PCR的方法扩增PCV-2 Cap基因,并将其克隆到pET28a(+)中,构建得到pET-Cap质粒,利用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切切下Cap基因3’末端396 bp的片段,插入到pET-LTB原核表达质粒LTB基因的3’末端,从而构建pET-LTB△Cap原核表达质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS后,用IPTG诱导重组菌,用SDS-PAGE电泳和Western blot检测诱导物。表达产物经初步纯化后用昆明系小白鼠做免疫保护实验。结果表明:pET-LTB△Cap重组融合表达质粒在大肠杆菌中实现了高效表达,融合蛋白分子量约为29Ku,表达量约占菌体蛋白的36.67%,融合蛋白能被PCV-2阳性血清识别。攻毒后,所有小鼠临床表现正常。用PCR检测有1/8的免疫小鼠感染了PCV-2,而对照组8只小鼠都感染了PCV-21。PCV-2 Cap基因3’端396 bp的片段与LTB基因融合能实现高效表达,表达产物免疫的小白鼠可抵抗PCV-2的攻击此研究为PCV-2基因工程疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(ltb) 融合表达 免疫原性
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EHEC O157:H7紧密黏附素C300与LTB融合基因克隆与序列分析 被引量:1
6
作者 蒋丽 姜炎硕 李明成 《北华大学学报(自然科学版)》 CAS 2010年第3期225-228,共4页
目的构建肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7紧密黏附素C-端免疫保护片段与肠黏膜佐剂大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的融合基因克隆载体,为进一步研究EHEC O157:H7重组疫苗奠定了基础.方法设计引物采用PCR技术从EHEC O157:H... 目的构建肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7紧密黏附素C-端免疫保护片段与肠黏膜佐剂大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的融合基因克隆载体,为进一步研究EHEC O157:H7重组疫苗奠定了基础.方法设计引物采用PCR技术从EHEC O157:H7基因组中扩增Intimin C300的编码基因,从肠产毒性大肠埃希菌基因组中扩增LTB的编码基因,分别构建克隆载体pUC18-C300和pUC18-LTB,采用酶切位点相连技术,构建pUC19-C300-LTB克隆载体,并测序.结果从EHEC O157:H7基因组中扩增出了900 bp的目的片段,从肠产毒素大肠埃希菌基因组扩增出了275 bp的目的片段,分别插入载体pUC18和pUC19,经酶切及测序鉴定与目的序列一致.结论克隆出EHEC O157:H7的紧密黏附素C-端免疫保护片段与不耐热肠毒素B亚单位基因,并成功构建融合基因克隆载体,测序正确. 展开更多
关键词 肠出血大肠埃希菌O157:H7 紧密黏附素C300 不耐热肠毒素B亚单位(ltb)
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Construction of a novel Shigella live-vector strain co-expressing CS3 and LTB/STm of enterotoxigenic E.coli 被引量:2
7
作者 Ji-PingZheng Zhao-ShanZhang Shu-QinLi Xiang-XinLiu Sheng-LingYuan PengWang De-WenZhan Ling-ChunWang Cui-FenHuang 《World Journal of Gastroenterology》 SCIE CAS CSCD 2005年第22期3411-3418,共8页
AIM: To construct and evaluate a polyvalent recombinant vaccine strain Shigella flexneri2a T32 against enterotoxigenic E.coli/(ETEC). METHODS: By using a host-plasmid balanced lethal system based on asd gene, a polyva... AIM: To construct and evaluate a polyvalent recombinant vaccine strain Shigella flexneri2a T32 against enterotoxigenic E.coli/(ETEC). METHODS: By using a host-plasmid balanced lethal system based on asd gene, a polyvalent recombinant strain was constructed to highly express CS3 and regularly express fusion enterotoxin of LIB subunit and mutant ST (LTB/STm) in a vaccine strain Shigella flexneri 2a T32 with specific deletion of asd gene. Fimbria CS3 was observed by immunofluorescence and electron microscopy assay. The security of LTB/STm was examined by ileal loop assay and suckling mouse assay. To evaluate this new candidate vaccine, it was compared with a previous vaccine strain in plasmid and protein level, growth assay and immunogenicity in Balb/c mice. RESULTS: The newly constructed vaccine expressed CS3 and grew better than the previously constructed vaccine except for the lower expression of LTB/STm. Serum IgG and mucosal IgA against CS3, LTB, ST, and host lipopolysaccharide (LPS) were produced after immunization of Balb/c mice by oral route with the new strain. The titers were not significantly different from the Balb/c mice with the previous strain. CONCLUSION: This novel candidate diarrheal vaccine can effectively induce serum and mucosal antibody responses against ETEC and Shigella. 展开更多
关键词 ETEC Shigella flexnerr CS3 LIB ST Vector vaccine IMMUNOGENICITY
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猪流感病毒多表位融合蛋白对小鼠的免疫原性分析
8
作者 师小潇 哈卓 +3 位作者 丁长根 潘洁 饶柏忠 刘惠莉 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期1284-1288,共5页
作者拟利用表位多肽的抗原性及黏膜佐剂免疫增强作用,设计可通过黏膜途径免疫接种的猪流感病毒通用型疫苗。体外合成H1N1、H3N2亚型猪流感病毒表位抗原基因,C末端串联大肠杆菌热敏性肠毒素LTb基因,构建pET30(a)-ep-LTb表达载体,利用SDS-... 作者拟利用表位多肽的抗原性及黏膜佐剂免疫增强作用,设计可通过黏膜途径免疫接种的猪流感病毒通用型疫苗。体外合成H1N1、H3N2亚型猪流感病毒表位抗原基因,C末端串联大肠杆菌热敏性肠毒素LTb基因,构建pET30(a)-ep-LTb表达载体,利用SDS-PAGE、Western blot分析重组融合蛋白表达及生物学特性,小鼠免疫试验分析融合蛋白免疫原性。SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约38ku,主要以包涵体形式存在。重组蛋白可与抗His-tag抗体和CTB抗体发生特异性反应。ELISA及HI试验检测,经黏膜途径免疫的小鼠产生了针对重组表位模拟抗原蛋白及H1N1、H3N2亚型猪流感病毒的血清抗体及局部黏膜分泌型IgA抗体。利用猪流感病毒表位抗原与LTb基因串连获得的融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,且在黏膜接种局部产生理想的分泌型IgA抗体,能有效阻断病原由黏膜局部感染,为研制猪流感病毒通用型疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 猪流感病毒表位抗原 大肠杆菌热敏性肠毒素B亚基(ltb) 免疫原性 通用疫苗
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大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位作为黏膜免疫佐剂的研究
9
作者 张璐思 罗泽宇 胡四海 《现代免疫学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期429-432,共4页
大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)是大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的组成部分之一,具有免疫原性,但无毒性,是一种较为理想的黏膜免疫佐剂。本文就大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的分子结构、介导的免疫反应及其黏膜免疫佐剂效应作一综述。
关键词 肠产毒型大肠埃希菌 不耐热肠毒素B亚单位(ltb 黏膜佐剂 黏膜免疫
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PT8A关键氨基酸残基鉴定及其免疫佐剂活性分析
10
作者 罗茹月 甘思杰 马永平 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第10期4840-4844,共5页
持粘膜和肌内佐剂的活性。PT8A来源于大肠杆菌耐热肠毒素B亚单位(LTB)的T细胞表位和B细胞表位(78~85 aa)。本研究共构建了3个PT8A突变体在HRV VP8*亚单位疫苗的C末端与VP8*基因融合。用分子内佐剂PT8A及其突变体蛋白对雌性Balb/c小鼠进... 持粘膜和肌内佐剂的活性。PT8A来源于大肠杆菌耐热肠毒素B亚单位(LTB)的T细胞表位和B细胞表位(78~85 aa)。本研究共构建了3个PT8A突变体在HRV VP8*亚单位疫苗的C末端与VP8*基因融合。用分子内佐剂PT8A及其突变体蛋白对雌性Balb/c小鼠进行鼻腔免疫,并用间接ELISA法检测血清IgG水平。VP8-CgR5(Q5G)和VP8-ChR8(A8H)突变株的血清特异性IgG水平均显著高于原株VP8-PT8A。结果表明,PT8A中Q5G和A8H的突变增强了PT8A的黏膜佐剂活性,PT8A的突变S4G对PT8A的佐剂活性无影响。 展开更多
关键词 PT8A突变体 不耐热肠毒素B亚单位(ltb) 分子内佐剂活性 轮状病毒VP8*
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