网状内皮组织增殖病病毒(REV)不同分离株LTR基因的序列分析

从山东、江苏的几个大型鸡场收集疑为REV感染的鸡脾脏、肝脏 ,提取组织DNA ,并以此为模板 ,通过PCR技术 ,从山东泰安及江苏海安的某鸡场中分别扩增到REV的LTR基因。将该基因克隆进TA载体中 ,转化大肠杆菌TG1,经酶切鉴定 ,得到了两株REVLTR基因的克隆 ,标记为SD和HA。将所得克隆测序并与国外报道的REVLTR基因进行比较 ,发现国内分离株与国外株有

靶向env及LTR基因的siRNA抑制ALV-J复制的研究

试验针对J亚群禽白血病病毒的env及LTR基因,根据它们的保守序列,分别设计合成了4～5对siRNA,并将其克隆至pSilencer 4.1,构建siRNA重组表达质粒。将该质粒转染DF-1细胞6 h后以103TCID50接种ALV-J,利用Real-time RT-PCR在mRNA表达水平检测各重组质粒对病毒复制的影响。结果表明,与阴性对照相比,pSi4.1-env各重组质粒对env基因的抑制效果达到18.15%～63.43%,pSi4.1-LTR各重组质粒的抑制效果则达到19.37%～45.41%。

以HIV-1 5'LTR为靶点的药物筛选细胞模型的构建

构建以人类免疫缺陷病毒(HIV-1)5'LTR为靶点的药物筛选细胞模型,用于体外筛选潜在的对HIV-1启动子具有抑制作用的药物,或用于筛选与HIV-1复制相关的宿主因子。通过PCR扩增HIV-1 5'LTR片段和胸苷激酶基因(thymidine kinase gene,TK基因),以这2片段为模板进行重叠PCR将两者连接起来,连接产物经酶切后与pcDNA3.1载体连接;将连接正确的质粒转染HEK293细胞同时用G418加压筛选获得稳定细胞系;加入药物更昔洛韦(GCV)检测TK基因的表达。成功构建了HIV-1 5'LTR调控TK基因表达的稳定细胞系,在其培养过程中加入药物更昔洛韦时,细胞逐渐死亡。构建了以HIV-1 5'LTR为靶点的药物筛选细胞模型,该模型利用TK基因作为报告基因方便灵敏,可用于筛选针对HIV-1 5'LTR的潜在抗HIV药物。

植物LTR-反转座子中Orf1基因的分子进化

LTR-反转座子是植物基因组的主要组成部分。它们在结构上非常保守,通常含有gag和pol两个基因,是完成其转座过程所必需的。在前期研究中,本项目组对大豆基因组SARE转座子家族进行了详细的分析。结果表明,该家族的拷贝中还存在第3个基因——Orf1。文章借助生物信息学的研究方法,对33个已测序的基因组进行了全基因组注释。结果发现,在7个植物基因组（桉树、杨树、棉花、大豆、百脉根、亚麻和苜蓿）中,部分LTR-反转座子元件在gag基因的上游存在约1~2kb未知的Orf1基因或基因片段。这类转座子多数在0~3百万年内插入到其所在的寄主基因组中,但它们在不同物种中的分子结构、发生的频率、扩增的强度和活跃的时期等方面差异较大。系统进化树分析表明,这类具有特殊结构的转座子较整齐的聚类到双子叶植物的一个进化分支上,表明它们可能是部分双子叶植物在进化过程中所产生的。不同物种间的相对保守性、大量拷贝的转录活性以及可能存在的多个功能结构域,提示Orf1基因可能具有一定的生物学功能。

盐胁迫下棉花LTR-反转座子的转录激活及在耐盐相关基因发掘中的应用

LTR-反转座子是棉花基因组的主要组成部分,在基因组中通常呈现"静止"状态。但受到胁迫刺激时,部分反转座子的转录活性可被"激活",可能影响邻近基因的表达。本研究在盐胁迫下通过生物信息学手段,在旱地棉转录组数据库中检测到3 885个转录激活的候选LTR-反转座子;这些候选LTR-反转座子上下游5 kb内共有1 787个邻近基因,其中377个邻近基因在盐胁迫下差异表达,通过对377个基因进行功能注释发现,326个基因注释到GO数据库中,并且部分基因与棉花已报道过的耐盐抗旱基因同源。本研究结果将为棉花的耐盐分子机理解析提供一定的理论基础。

马传染性贫血病毒基因非编码区LTR嵌合克隆的构建

在已有全长感染性克隆pLGFD3 8 和pD70344 的基础上,根据马传贫弱毒疫苗致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,在LTR U3区选取特定的酶切位点对EIAV非编码区LTR基因进行了部分替换。将替换的全基因克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)并以驴白细胞(DL)传代,用逆转录酶活性检测、RT PCR方法及Real time RT PCR验证其感染性。结果发现,其衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT PCR阳性。电镜下可见大量典型的EIAV颗粒。pLGFD9 12 嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3 8具有相似的复制水平,pLGFD9 12嵌合克隆衍生病毒在DL细胞上复制水平略高于FDD细胞。此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础。

马传染性贫血病毒LTR在驴胎皮肤细胞中的基因进化及启动子活性比较

将EIAV驴白细胞弱毒疫苗株在驴胎皮肤细胞中连续传代,分别提取第13代、18代、21代、23代、26代病毒培养物的前病毒DNA,以LTR特异性引物PCR扩增前病毒LTR,并进行克隆及测序分析。与本实验室已测定的驴白细胞毒株LTR的序列比较发现,驴胎皮肤细胞毒株LTR的U3负调节区出现大段的插入、点突变、缺失,U3增强子区变异较小。将LTR片段插入到pCAT-basic载体CAT报告基因前,转染驴胎皮肤细胞,通过检测CAT表达量来评价LTR的启动子活性。驴胎皮肤细胞毒株LTR的启动子活性随着病毒传代次数的增加而逐渐增强,而驴白细胞弱毒株LTR的启动子活性很低。

cmv-3′LTR嵌合启动子对逆转录病毒载体MFG滴度及外源基因表达的影响

为减轻逆转录病毒载体介导的外源基因的沉默,进一步提高逆转录病毒载体MFG介导的外源基因的表达水平,同时探讨逆转录病毒3′端长末端重复序列(long terminalrepeat,LTR)内U3区对病毒基因表达的影响,将逆转录病毒载体3′端LTR内的U3区用cmv核心增强子、启动子序列替代,同时去除了3个与逆转录病毒载体启动子甲基化有关的序列NCR、DR,并以egfp为报告基因,构建了MFG egfp和MFG egfp cmv表达载体。结果显示:利用cmv启动子替代MFG载体3′端LTR的U3启动子序列,会显著降低MFG载体的病毒滴度及其介导的外源报告基因的表达。提示利用cmv启动子替代病毒载体的3′端LTR内的U3区,并不是提高MoMLV(moloneymurineleukemivirus)逆转录病毒载体介导外源基因的表达及其病毒滴度的理想策略。结果也同时提示:在MoMLV逆转录病毒3′端LTR的U3区,可能存在与病毒RNA加工、成熟及稳定性有关的信号序列。

萤火虫萤光素酶基因构建BIV－LTR启动子表达研究体系

萤火虫萤光素酶基因构建ＢＩＶ－ＬＴＲ启动子表达研究体系刘国文，纪永刚，梁臣，刘淑红，陈启民，耿运琪（南开大学生命科学学院天津３０００７１）关键词萤光虫萤光素酶基因（ｌｕｃ），ＢＩＶ－ＬＴＲ，ＢＩＶ－ｔａｔ目前使用最广泛的报道基因是细菌的氯霉素乙酰转移...

应用聚合酶链式反应检测禽痘病毒田间分离株及疫苗株中网状内皮组织增殖病毒LTR片断,env及re1基因

本文利用聚合酶链式反应对来自澳大利亚昆士兰州、维多利亚州和新南维尔士州的４株禽痘病毒田间分离株及二疫苗株中网状内皮组织增殖病毒的ＬＴＲ片断、ｅｎｖ及ｒｅｌ基因因进行了检测。所有４株痘病毒分离株均为ＬＴＲ片断、ｅｎｖ阳性，曾被ＰＣＲ证实为ＬＴＲ阳性的一疫苗株在本实验中也为ＬＴＲ、ｅｎｖ阳性，另一疫苗株为ＬＴＲ、ｅｎｖ阴性，所有上述禽痘病毒株均为ｒｅｌ阴性。

烟草中一个LTR类反转录转座子基因的克隆与功能分析

[目的]分析烟草中LTR类反转录转座子对植物生长发育的影响。[方法]利用同源克隆及RACE的方法,从烟草栽培品种‘贵烟1号’c DNA中克隆得到了1个烟草反转录转座子的全长c DNA序列,命名为Ntrt1(Gen Bank登录号:KC899077)。利用实时定量RT-PCR研究了该基因在烟草不同组织中的表达水平;构建了基于双生病毒卫星诱导的Ntrt1的基因沉默载体,以中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)为辅助病毒在烟草中沉默了该基因,并调查了基因沉默后的表型。[结果]序列分析表明:该基因全长5 046 bp,编码3个ORF,分别为Gag/pol多聚蛋白、反转录转座子的中心蛋白以及一个整合酶。该基因能在烟草的根、茎、叶中表达,在叶片中的表达量最高。Ntrt1基因沉默烟草与对照相比,烟草植株明显变矮。[结论]Ntrt1在烟草的生长发育中具有重要作用。

无芒隐子草全基因组水平全长LTR反转录转座子鉴定及其中断基因分析

LTR反转录转座子是植物基因组内大量可移动的遗传因子,是基因组的重要成分之一。无芒隐子草基因组大小为543 M,全基因组中共鉴定出了299079个LTR反转录转座子,占全基因组的26.54%,但是缺少无芒隐子草全长LTR反转录转座子的研究。基于无芒隐子草全基因组序列,筛选出具有潜在活性的全长LTR反转录转座子845个,其中有410个属于Gypsy超家族,435个属于Copia超家族。对这些序列进行了系统进化树的构建和插入时间的分析,发现全长LTR反转录转座子的大量转座发生在4百万年内,插入时间较近,插入高峰期是1~1.5百万年间。筛选出被全长LTR反转录转座子中断的基因有183个,145个被中断的基因得到了GO功能注释,分析了被中断基因在不同干旱胁迫处理下的基因表达模式。对反转录转座子的鉴定有助于深入了解无芒隐子草的进化过程,为无芒隐子草全长LTR反转录转座子与中断基因的后续研究奠定基础。

HIV-1 Tat蛋白结合Tar的抗艾滋病药物筛选模型的建立研究

目的建立H IV-1 Tat蛋白结合Tar的抗H IV-1药物筛选模型用于抗H IV药物筛选。方法构建表达H IV-1Tat蛋白的真核表达质粒(pCDNA3.1(+)-Tat)和H IV-1 LTR-luc荧光素酶报告基因,采用脂质体转染法共转染HeLa细胞,荧光仪检测Tat蛋白促进荧光素酶在HeLa细胞内的表达情况,建立H IV-1Tat蛋白结合Tar的细胞模型,用于抗H IV-1的药物筛选。以DRB(5,6-二氯-1-β-呋核亚硝脲-苯并咪唑)为阳性对照,进行模型的建立及条件的优化。结果通过反复试验表明,目的基因和报告基因的配比、转染时培养液中小牛血清的含量、细胞浓度、转染前细胞状态以及药物作用时间的长短等对模型的稳定性和敏感性有影响。结论应用优化的细胞模型对文冠果、紫苏等浸提物进行筛选及结果的分析。

禽网状内皮组织增殖病病毒SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测方法的建立

为了探究禽网状内皮组织增殖病的快速检测方法,根据禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)LTR和gag基因的保守区域各设计并合成一对引物,建立检测插入感染与全病毒感染的SYBR Green I模式的实时荧光PCR方法(Real-time PCR)。以pMD-LTR,pMD-gag重组质粒为标准品建立标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价。结果表明:该方法线性关系良好;敏感性能检测到10拷贝标准品;能特异性检测REV样品,不与其它禽相关病原发生交叉反应;板内、板间重复试验的变异系数均低于3%。应用该方法对人工感染REV的鸡的心、肝、脾、肺、肾、盲肠扁桃体、腺胃和法氏囊进行初步检测,结果显示法式囊中的含量最高。

牛泡沫病毒内部启动子的克隆及功能分析

以该实验室分离并鉴定的牛泡沫病毒 (BFV)中国毒株 (BFV3 0 2 6)为材料 ,用PCR方法首次克隆了位于 env 基因 3′端的内部启动子 ,经序列分析后 ,引入luc基因作瞬时表达分析。结果表明 ,该内部启动子不但基础活性高于LTR ,而且转录活性在Tas参与下被大大激活 ,其激活活性也远远高于LTR。同源分析表明 ,非灵长类泡沫病毒内部启动子之间的同源性高于其与灵长类泡沫病毒内部启动子之间的同源性。

shRNA随机文库结合TK自杀基因筛选靶向HIV-1 LTR相关宿主因子

构建shRNA随机文库与HIV-1 LTR启动胸苷激酶基因(TK基因)稳定表达的稳定细胞系HEK293/TK,将两者结合起来,筛选靶向HIV-1 LTR相关宿主因子。方法:通过化学合成含有19个随机脱氧核苷酸的发夹结构,将其退火补平后与合成的接头Linker连接进行PCR反应,将PCR产物酶切后置于慢病毒载体pLenti-U6启动子下游由此构建shRNA随机文库;利用重叠PCR将HIV-1 LTR片段和TK基因连接起来,连接产物经酶切后与pcDNA3.1载体连接;将连接正确的质粒转染HEK293细胞同时用G418加压筛选获得稳定细胞系HEK293/TK;将所获得的文库质粒包装成慢病毒后侵染所构建的HEK293/TK细胞系,通过加入药物GCV进行加压筛选获得存活细胞。结果:成功筛选到加药后存活下来的细胞,抽提细胞基因组,采用巢式PCR扩增目的干扰序列并用Western blot对干扰序列进行验证,鉴定获得一个克隆所表达的shRNA能对TK基因的表达起到抑制作用,通过测序分析获得其干扰序列,该序列很有可能针对HIV-1 LTR某宿主相关因子。结论:成功构建了一种筛选HIV-1 LTR相关宿主因子的方法,筛选所得序列可以定位到具体相关宿主因子,为靶向筛选抗HIV-1药物提供了重要手段。

乌骨鸡J亚型禽白血病病毒的分离及其全基因组遗传进化分析

为了解云南地方品种盐津乌骨鸡感染禽白血病病毒(ALV)的情况,从云南省盐津县某规模化盐津乌骨鸡种鸡场中分离ALV,并对1株ALV-J(YN2021株)的全基因组进行序列分析。结果显示,该场乌骨鸡的ALV感染阳性率为16.66%,以ALV-J亚型感染为主,也存在ALV-B亚型单独感染和ALV-J/B亚型混合感染。测序表明YN2021株基因组全长7 618 bp,与参考毒株核苷酸同源性为65.0%~97.1%,其中env基因N端糖基化位点与参考毒株存在差异;遗传进化分析显示,YN2021株可能是由ALV广东株和广西株重组产生的。本研究首次报道了云南地方品种盐津乌骨鸡中ALV-J的全基因序列,为我国研究ALV-J遗传进化奠定了基础。

HIV-1 Tat真核表达载体的构建及在内皮细胞的表达

目的:构建HIV-1 Tat真核表达质粒,为研究Tat在HIV-1致病机制中的作用奠定实验基础。方法:以pCV1(tat and rev)质粒为模板,用PCR方法扩增HIV-1 Tat基因,克隆至p cDNA3.1(+)表达载体,酶切及测序鉴定重组体。重组质粒转染ECV304细胞,用RT-PCR、转染HIV-1 LTR荧光报告基因的方法检测tat基因的表达及活性。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建pcDNA3.1(+)-Tat重组质粒。重组体转染ECV304细胞,建立稳定表达细胞株,应用RT-PCR可检测到Tat基因mRNA的表达;荧光仪检测Tat蛋白可明显促进荧光素酶在ECV304细胞内的表达。结论:成功构建HIV-1Tat真核表达载体,并建立了HIV-1 Tat内皮细胞稳定表达细胞株。