牛疱疹病毒Ⅰ型二重LUX荧光PCR鉴别检测方法的建立

采用LUX新型荧光PCR技术原理，建立了快速检测牛疱疹病毒I型（BHV-1）以及鉴别野毒感染和基因缺失疫苗免疫动物的二重实时荧光PCR方法。结果显示，该方法对多株BHV-1病毒均呈典型gE、gC双基因阳性反应，对其他常见动物疱疹病毒以及健康牛基因组DNA等均呈阴性反应；对细胞增殖病毒液的gE、gC双基因鉴别的检测敏感性可达0．4～O．04TCID50比常规PCR方法高100倍以上；对带毒牛血清、抗凝全血、牛新鲜精液和冷冻精液基因鉴别的检测敏感性分别达0．04TCID50、0．4TCID50、0．4TCID50和4TCID50。采用该方法从临床牛血样、鼻拭子样品中检出IBRV阳性样品，检测全程仅需约2h。对单基因克隆质粒的检测进一步证实该方法能特异地鉴定gE、gC基因，检测灵敏度分别达90、30拷贝。结果表明，该方法可应用于临床快速诊断BHV-1病毒感染，鉴别BHV-1病毒感染与对应的基因缺失疫苗免疫动物。

水泡性口炎病毒血清型特异LUX实时荧光RT-PCR检测方法的建立

采用LUX荧光核酸扩增技术原理,以水泡性口炎病毒(VSV)NJ、IND型NS基因为模板分别设计并合成单标记LUX荧光引物,建立血清型特异的VSV荧光RT-PCR检测方法。试验表明,两种型特异的LUX荧光RT-PCR能分别特异地鉴定VSV血清型,对口蹄疫、猪水泡病等病毒以及对照细胞、健康动物组织RNA样品的检测结果均为阴性。对比检测试验表明,LUX荧光RT-PCR的检测敏感性比常规RT-PCR提高达10倍以上,对VSV细胞增殖病毒液的检测灵敏度可达1 TCID50。对人工感染豚鼠样品以及临床样品的检测试验证实,该LUX荧光RT-PCR可有效检测到人工感染动物组织以及进口牛临床样品中的水泡性口炎病毒,并能鉴定感染病毒血清型。所报道的检测方法,包括样品核酸提取、LUX荧光RT-PCR以及熔解曲线分析,可在3 h内完成。

牛白血病病毒LUX^TM实时荧光聚合酶链式反应检测方法的建立

采用LUXTM新型荧光PCR技术原理,设计并合成1对单标记LUXTM荧光引物,建立了LUXTM荧光PCR和RT-PCR方法,可快速检测牛白血病病毒(BLV)前病毒DNA和病毒RNA。结果显示所建立的LUXTM荧光PCR/RT-PCR体系可特异检测牛白血病病毒核酸,而对蓝舌病、牛病毒性腹泻-粘膜病、水泡性口炎、口蹄疫、牛流行热、牛传染性鼻气管炎等病毒核酸以及牛结核分支杆菌、大肠杆菌、健康动物组织核酸扩增均呈阴性反应。敏感性实验表明LUXTM荧光RT-PCR对RNA前病毒的检测敏感性达0.49 ng/μL,荧光PCR对pTblv-gp51重组质粒的检测敏感性可达0.138拷贝,比OIE规程的巢式PCR方法高104倍以上。采用该方法从血清学阳性临床牛血清中检出BLV阳性样品。

牛流行热病毒LUX^(TM)荧光RT-PCR检测方法的建立

采用LUXTM荧光PCR技术原理,以牛流行热病毒(BEFV)糖蛋白抗原G基因保守序列为模板设计特异荧光PCR扩增引物,建立BEFV LUXTM实时荧光RT-PCR快速检测方法。试验结果显示,所建立的荧光RT-PCR可特异检测牛流行热病毒RNA,而对蓝舌病病毒、牛病毒性腹泻-粘膜病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛白血病病毒以及与BEFV同种属的狂犬病病毒核酸检测呈阴性反应。敏感性试验表明LUXTM荧光RT-PCR对BEFV RNA的检测敏感性比常规RT-PCR方法提高达100倍以上。该LUXTM荧光RT-PCR的批内检测变异系数0.64%-1.17%,批间检测变异系数均小于2%,表明检测体系稳定、重复性好。通过人工添加灭活病毒液的方法制备30份模拟感染牛血清样品,采用上述所建立的BEFV LUXTM荧光RT-PCR方法检测均呈阳性。