LuxS/AI-2群体感应系统在乳酸菌细菌素合成中的作用

乳酸菌细菌素具有抑菌谱广、稳定性高、安全性高等优势,作为新型生物防腐剂备受青睐,但目前工业化应用的细菌素数量有限,合成量低是其应用受限的重要原因。国内外研究显示与特定的微生物共培养是提高乳酸菌细菌素合成量的有效方法,该过程受到LuxS/AI-2群体感应系统的调控。文章从乳酸菌LuxS/AI-2群体感应系统的组成及LuxS/AI-2群体感应系统在乳酸菌细菌素合成中的作用两个方面进行论述,为乳酸菌细菌素合成量的提高和工业化应用的实现提供了一定的理论依据。

基于LuxS/AI-2群体感应系统研究疮愈膏促进肛周慢性创面愈合的作用机制

目的:研究疮愈膏对肛周慢性创面形成的抑制作用及其对创面细菌生物被膜主要调控基因LuxS和信号分子AI-2的影响。方法:采用SD大鼠60只(200±20)g雄性大鼠随机分为普通创面组(n=15),实验组(n=15),阳性对照组(n=15),安慰剂组(n=15);通过背部新鲜创面每日滴加离心粪液构建肛周慢性创面模型。造模成功后,实验组给予疮愈膏外敷,阳性对照组给予莫匹罗星软膏外敷,安慰剂组给予凡士林纱条外敷,普通创面组给予生理盐水纱条外敷,1次/d,持续14 d。于治疗前和治疗后对各组大鼠创面进行记录分析;实时荧光定量聚合酶链式反应(RTPCR)检测生物被膜主要调控基因LuxS的变化;哈氏弧菌测定AI-2信号分子活性。结果:与安慰剂组比较,实验组和阳性对照组大鼠创面面积均明显缩小,差异具有统计学意义(P<0.05);实验组与阳性对照组差异无统计学意义。与安慰剂组对比,实验组和阳性对照组大鼠创面组织提取细菌中LuxS mRNA相对表达量,信号分子AI-2活性均明显降低(P<0.05),实验组和阳性对照组则无明显差异(P<0.05)。结论:疮愈膏能够加速肛周慢性创面的愈合同时抑制创面细菌生物被膜的形成,其机制可能与下调创面细菌LuxS基因的表达及降低其AI-2信号分子活性有关,LuxS/AI-2群体感应系统可能为疮愈膏治疗肛周慢性创面的机制之一。

变形链球菌LuxS基因缺失对生物膜结构的影响探究

目的探究变形链球菌LuxS基因缺陷株与标准株在生物膜结构上的差异。方法采用釉质磨片为载体,将变形链球菌标准菌株及luxS基因缺陷株按照1∶1比例接种于培养基中,通过培养后观察两者菌落形态学的变化和生长曲线的变化,比较两者生物膜中单个细菌的情况,比较两者在24 h后形成的生物膜结构情况,采用RT-PCR检测菌液中信号分子自诱导物(AI)-2 mRNA的表达水平。结果变形链球菌标准菌株和LuxS基因缺失菌株在菌落形态学上未见明显的表型差别,两者生长曲线的总体变化一致,两者形成的生物膜存在差异,变形链球菌标准菌株形成生物膜结构更紧密,而缺陷株生物膜菌间结构比较稀疏,RT-PCR检测变形链球菌LuxS基因缺陷株的AI-2 mRNA表达水平低于标准菌,差异有统计学意义(P<0.05)。结论变形链球菌LuxS基因缺陷株与标准株在离体模型上培养的生物膜结构发生了变化,LuxS基因缺失会影响生物膜结构。

反刍动物瘤胃微生物LuxS/AI-2群体感应研究进展

群体感应(quorum sensing, QS)是细菌利用信号分子进行种内或种间交流的一种通讯机制,借助该通讯机制微生物群体可以实现微生物个体无法完成的生理功能或行为调节,如生物膜形成、毒素分泌和生物发光等,以增强对外界胁迫环境的适应性。近期多组学研究发现,以自体诱导物-2(autoinducer-2, AI-2)为信号分子、LuxS为调节蛋白介导的LuxS/AI-2 QS是瘤胃微生物之间交流的主要通讯机制,影响着瘤胃微生物对饲料的利用效率。本文从AI-2的化学结构和转导途径对微生物LuxS/AI-2 QS进行总结,对LuxS/AI--2 QS在反刍动物瘤胃微生物定殖和饲料消化过程中的作用进行综述,并对LuxS/AI-2 QS在饲料消化、应激调控中的潜在作用进行展望,以期为通过LuxS/AI-2 QS调控瘤胃微生物消化代谢和稳态的生产策略提供理论参考。

植物乳杆菌HE-1由AI-2/LuxS介导的群体感应与生物膜形成关系的研究

本研究从AI-2/LuxS群体感应出发,研究植物乳杆菌HE-1的AI-2信号分子生成与生物膜形成的关系,同时对luxS基因进行扩增,从分子生物学角度验证菌株HE-1的AI-2信号分子产生。研究使用生物发光的方法检测植物乳杆菌HE-1不同培养时间AI-2的产生量;使用微孔板法确定不同时间点生物膜的生成量;之后使用PCR的方法扩增其luxS基因片段,对扩增片段进行同源性和系统发育分析。结果显示植物乳杆菌HE-1的生物膜生成时间和生成量与AI-2信号分子的产生时间和产生量非常吻合,luxS基因成功扩增,同源性分析显示植物乳杆菌HE-1与已知植物乳杆菌luxS基因同源性高达99%以上。分析实验结果得出植物乳杆菌HE-1生物膜生成与AI-2/LuxS群体感应系统二者之间有密切的关系,并且luxS基因的扩增成功和同源性分析从分子生物学上验证了植物乳杆菌HE-1具有产生AI-2信号分子的关键基因。

产膜表皮葡萄球菌LuxS/AI-2型密度感应系统AI-2的活性及苦参碱对其的影响

【目的】研究产膜表皮葡萄球菌生物被膜菌和液相浮游菌LuxS/AI-2型密度感应系统中AI-2信号分子的活性及苦参碱对其的影响。【方法】绘制产膜表皮葡萄球菌ATCC35984液相浮游菌及生物被膜菌的生长曲线;利用哈维氏弧菌BB170(Vibrio harveyi BB170)作为报告菌株检测表皮葡萄球菌AI-2信号分子的活性;用荧光定量PCR法检测luxS基因的转录水平;用苦参碱对产膜表皮葡萄球菌ATCC35984进行处理,检测其AI-2信号分子活性的变化情况。【结果】在产膜表皮葡萄球菌液相浮游菌生长过程中,AI-2信号分子与luxS基因的相对表达量都是在对数生长期达到最大值,而后逐渐降低,与液相浮游菌生长曲线基本一致。在产膜表皮葡萄球菌生物被膜菌生长过程中,AI-2信号分子活性曲线与其生物被膜生长曲线变化趋势一致,但luxS基因的相对表达量曲线与生物被膜生长曲线变化趋势相反。中药苦参碱对产膜表皮葡萄球菌液相浮游菌和生物被膜菌AI-2信号分子活性有抑制作用,并且对液相浮游菌AI-2信号分子活性的抑制作用强于生物被膜菌。【结论】AI-2信号分子活性和luxS基因的相对表达量与产膜表皮葡萄球菌生物被膜菌及其液相浮游菌的生长相关;苦参碱能够显著下调产膜表皮葡萄球菌生物被膜菌和液相浮游菌的AI-2信号分子活性。

LuxS/AI-2型群体感应系统调控细菌生物被膜形成研究进展

生物被膜是大多数细菌在自然状态下的一种生长方式,使菌体具有浮游态时不具有的优势。它的形成和发展受到群体感应系统的调控,该系统是细菌依赖于群体密度而调控其生理行为的一种机制。其中Lux S/2型自诱导物(autoinducer 2,AI-2)群体感应系统又称种间群体感应系统,广泛存在于G^(+)及G^-菌中。其信号分子AI-2被认为是种间通用的信号分子,参与调控多种细菌的生物被膜。此外,目前已发现多种Lux S/AI-2型群体感应系统抑制剂,它们可以影响许多细菌生物被膜的形成。目前研究人员已开始致力于揭示Lux S/AI-2型群体感应系统调控生物被膜形成的分子机制,这对于进一步理解Lux S/AI-2型群体感应系统与生物被膜的关系具有重要意义。

重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件的优化

目的：优化重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件,提高具有生物活性的重组蛋白LuxS的表达量,为体外合成自诱导物2（autoinducer-2,AI-2）奠定基础。方法：采用单因素试验,优化诱导培养基、诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及异丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）的浓度;采用Ni-NTA Purification System对重组蛋白进行纯化,比较Native Elution Buffer的咪唑浓度和pH值对重组蛋白纯化的影响,确定最佳的Native Elution Buffer;对比蛋白与树脂结合时不同缓冲液的纯化效果,选择最优的结合缓冲液。结果：重组蛋白的最佳诱导表达条件为：以LB培养基为诱导培养基,菌液OD6_（600nm）为0.6~0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导温度为37℃,诱导时间为12 h。采用添加3 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液作为蛋白与树脂结合的缓冲液,含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）作为蛋白洗脱液。使用分离获得的LuxS蛋白合成的AI-2生物活性约为阳性对照的6倍。结论：本研究成功优化了重组蛋白LuxS的诱导表达及纯化条件,获得了具有生物活性的重组蛋白,并成功合成了AI-2。

嗜水气单胞菌ATCC7966 luxS基因缺失株构建及特性研究

目的研究群体感应信号分子AI-2合成酶编码基因luxS对嗜水气单胞菌ATCC 7966生理特性及毒力因子的影响。方法利用同源重组原理,构建含有中间为卡那霉素抗性基因,两侧为luxS基因上、下游同源序列片段的基因敲除质粒,将构建好的质粒转化大肠埃希氏菌SM 10(λpir)感受态细胞,利用接合法将质粒转入嗜水气单胞菌ATCC 7966,通过抗性筛选、PCR和DNA测序确认嗜水气单胞菌luxS基因缺失突变株。比较野生株ATCC 7966和luxS基因缺失突变株生长速度、AI-2合成、胞外蛋白酶合成及生物膜形成的差异。结果嗜水气单胞菌luxS基因缺失突变株ΔluxS构建成功。与野生株相比,突变株生长周期延长,基本丧失合成AI-2和胞外蛋白酶的能力;突变株生物膜形成能力降低,生长24h时生物膜形成能力为野生株的14.5%,36h时生物膜形成能力为野生株的60.0%,突变株生物膜形成速度明显比野生株缓慢,结构更为疏松。结论 luxS基因参与调控嗜水气单胞菌的生长、AI-2合成和毒力因子表达,本研究为进一步研究luxS基因在嗜水气单胞菌致病性中发挥的作用奠定基础。

变异链球菌luxS基因对多糖基质代谢的影响

目的:利用变异链球菌luxS基因敲除的突变株,研究该基因缺陷对于生物膜多糖基质的影响。方法:通过向生物膜培养悬液中加入与细菌直径相近的磁性小珠,利用这些小珠由于生物膜约束而在磁场中位移受限的原理,采用生物膜定量分析仪,定量比较luxS突变株与野生株在利用外源性碳水化合物合成生物膜多糖基质能力方面的差异。采用SPSS 10.0软件包对实验数据,进行Dunnet双侧t检验。结果:变异链球菌luxS基因突变株与野生株均可利用碳水化合物合成胞外多糖基质,且外源性糖的加入可显著促进生物膜的形成。在加入1%蔗糖时,2菌株生物膜均在1h内迅速形成,而两者之间无显著差异。在加入1%葡萄糖时,两菌株的生物膜形成速度均有所加快,突变株的改变则更为明显。结论:luxS基因参与调节细菌对多糖基质代谢的过程,而其对于生物膜形成的影响也更多是通过调节多糖基质代谢实现的。

变形链球菌luxS基因突变对口腔混合细菌生物膜的影响

目的 :研究致龋菌变形链球菌luxS基因在口腔细菌混合培养形成牙菌斑生物膜中的作用。方法 :将变形链球菌野生株(UA159)及其2种luxS基因突变株(luxS基因高表达株和luxS基因缺陷株)分别与口腔细菌嗜酸乳杆菌(ATCC4356)按照1∶1比例接种于牛心脑浸液培养基,体外混合培养不同时间,包括生物膜形成过程中的初期(4 h)、中期(14 h)、晚期(24 h),通过MTT法检测混合菌在生物膜形成的量。通过激光共聚焦显微镜观察混合细菌24 h形成的生物膜结构,实时定量PCR检测变形链球菌相关基因(ftf, smu630, brpA, gbpB, gtfB, vicR, comDE和relA)的表达。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果:变形链球菌野生株及其2种luxS基因突变株与嗜酸乳杆菌混合培养14 h后,生物膜的量分别为0.481±0.024、0.591±0.023和0.279±0.019;24 h后,混合细菌形成生物膜的量趋势与该时间点一致,变形链球菌高表达株高于野生株,而缺陷株明显降低;但4 h后形成的生物膜组间无显著差异。激光共聚焦显微镜结果表明,高表达株和野生株的集聚程度更高,形成生物膜的结构更加紧密;而缺陷株生物膜菌间结构比较稀疏。以变形链球菌野生株和嗜酸乳杆菌混合形成的生物膜中相关基因的表达为标准,高表达株相关基因的表达均增加,缺陷株表达均降低,且各组间存在显著差异(P<0.05)。结论:变形链球菌luxS基因影响与具核梭杆菌混合培养形成的牙菌斑生物膜,为进一步研究该基因在生物膜中的作用及其调控机制提供了依据。

肠炎沙门菌luxS缺失株的构建及其生物学特性研究

拟研究LuxS/AI-2群体感应系统对肠炎沙门菌(Salmonella enterica Serovar Enteritidis,SE)生物学特性的影响。利用Red同源重组系统构建LuxS/AI-2系统关键基因luxS缺失株,通过比较亲本株和luxS缺失株体外生长速率、药物敏感性、细胞黏附侵袭能力及生物被膜形成能力等生物学特性,初步分析AI-2/LuxS系统对SE生物学特性的影响。结果显示,luxS缺失株能够稳定遗传缺失的△luxS基因;体外生长速率略快;生物被膜形成能力明显增强;对DF-1细胞和Caco-2细胞黏附侵袭能力均显著增加;对氟喹诺酮类药物敏感性提高128~256倍,对氨苄西林、四环素、多西环素、氯霉素和氟苯尼考类等的药物敏感性提高了8倍。以上结果表明,LuxS系统影响肠炎沙门菌的生物学特性(如生物被膜形成、对细胞的黏附侵袭能力),并且该系统也通过某种耐药机制影响肠炎沙门菌的药物敏感性。

luxS基因对盐胁迫下植物乳杆菌生长及细菌素合成的影响

以植物乳杆菌KLDS1.0391野生株及其luxS基因缺失突变株为研究对象,探究luxS基因对该菌盐耐受能力的影响,并测定在0%、2%、3%、4%和6%质量分数NaCl胁迫条件下,luxS基因缺失对该菌生长及细菌素合成的影响,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术在转录水平上测定该菌细菌素合成相关基因的表达水平。结果表明:随NaCl质量分数的升高,2株菌的存活率均逐渐下降,当NaCl质量分数大于3%时,相同条件下野生株对盐的耐受能力显著强于突变株(P<0.05);除此之外,NaCl质量分数越高,菌株进入稳定期的时间越向后延迟,luxS基因缺失突变株在各NaCl质量分数下生长及细菌素合成能力均显著弱于野生株(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,当培养至稳定期24 h时,细菌素结构基因plnEF以及双组分调节基因plnD和plNC8HK均因luxS基因的缺失,表达显著下调(P<0.05)。因此,luxS基因缺失显著降低植物乳杆菌KLDS1.0391盐耐受能力,并且在NaCl胁迫条件下,该菌生长及细菌素合成能力也因luxS基因缺失而显著下降。

细菌中LuxS/AI-2密度感应系统分子机制研究进展

近年来的研究证明，细菌之间存在信息交流，许多细菌都能合成并释放一种称为自诱导物质（autoinducer，AI）的信号分子。胞外的AI浓度能随细菌密度的增加而增加。当达到临界浓度时，AI能结合并激活细胞内受体，启动菌体中相关基因的表达，从而调控细菌的生理行为，产生毒力因子等，使细胞的活动具有组织性，成为类似于多细胞生物的群体性活动。

luxS基因敲除临床分离大肠杆菌株生物膜形成能力的变化

目的探讨LuxS基因对临床分离大肠杆菌生物膜形成能力的影响。方法以临床分离大肠杆菌S17为研究对象,PCR分别扩增S17 LuxS基因的上下游序列和质粒pEGFP-N1的卡那抗性基因,分别连入T载体pAT2,再通过酶切连接的方法分别将LuxS基因的上、下游序列连接入pAT2-kana质粒,构建同源重组质粒pAT2-△luxS,同源重组质粒转化大肠杆菌DH5α扩增后,提取质粒后双酶切获得同源重组片段,将同源重组片断电转入感受态S17,通过同源重组构建LuxS基因缺失的S17,96孔板结晶紫染色法分析LuxS基因缺失株生物膜形成能力的变化。结果 LuxS基因缺失株基因组PCR扩增出1678的片断,测序鉴定正确,成功构建临床分离大肠杆菌S17 LuxS基因缺失株,S17与S17LuxS基因缺失株形成生物膜的微孔板法半定量OD值的结果分别为(1.51±0.09)和(0.43±0.13)。结论 LuxS基因对细菌生物膜的形成具有重要调控作用。

变异链球菌LuxS基因缺陷突变株的构建及其生物膜结构的初步观察研究

目的:通过同源重组法构建变异链球菌LuxS基因缺陷突变菌株,比较其与变异链球菌UA159标准株在生物膜形成上的差异。方法:运用基因同源重组方法将氯霉素抗性基因(Cmr)与LuxS基因上下游区域的2个基因片段按一定顺序重组到PUC载体的多克隆位点中,构建出带氯霉素抗性标志的重组质粒,将载体质粒转化到含完整LuxS基因的变异链球菌UA159中,利用氯霉素抗性筛选出LuxS基因缺陷的突变株,并利用聚合酶链式反应(PCR)和哈氏弧菌发光实验进行检测。以釉质磨片为载体,在扫描电镜下观察上述两菌株含有20 g/L葡萄糖、20 g/L蔗糖的乳酪消化胨酵母(TPY)液体培养基中形成24 h的生物膜。结果:PCR基因扩增结果显示:突变株LuxS基因已被Cmr基因完全替换,成功的构建了变异链球菌LuxS基因突变株,并且突变株不能诱导哈氏弧菌BB170的生物发光。当用葡萄糖作为补充糖源时,变异链球菌UA159标准株和LuxS基因突变株所形成的生物膜表现型未见明显差异;而用蔗糖作为补充糖源时,两菌株所形成的生物膜有明显不同,UA159生物膜相对平滑均质,而LuxS基因突变株生物膜呈松散的蜂房状,基质间有较大的间隙,形成较大的团簇状菌落。结论:成功构建出LuxS基因缺陷的变异链球菌突变株,与变异链球菌UA159标准株其生物膜结构发生改变,提示LuxS会影响变异链球菌生物膜的形成。

LuxS/AI-2对伤寒沙门菌基因表达的调节

目的:探讨伤寒沙门菌luxS基因在葡萄糖存在下对细菌对数生长中期基因表达调控的影响。方法:应用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌luxS基因缺陷变异株;比较野生株与缺陷株的生长情况及动力差异;用哈氏弧菌BB170作为报告菌株检测不同时期野生株与缺陷株的生物发光;利用伤寒沙门菌全基因组芯片技术,比较在葡萄糖存在下伤寒沙门菌野生株和luxS基因缺陷变异株的对数生长中期基因表达谱差异,并选择部分差异表达基因进行实时定量PCR验证。结果:经PCR及序列分析证实,伤寒沙门菌luxS基因缺陷变异株制备成功;在葡萄糖存在下野生株发光均比无葡萄糖时强,在对数生长中期时AI-2产生的荧光最强,而luxS缺陷株不发光;luxS不影响细菌生长但影响细菌的动力;基因表达谱比较分析结果表明,与野生株相比,luxS缺陷株有47个基因表达上调,27个基因表达下调;实时定量PCR结果与芯片分析一致。结论:伤寒沙门菌中luxS基因能参与信号分子AI-2的合成,且LuxS/AI-2在细菌对数生长中期的基因表达调控中发挥重要作用。

变异链球菌LuxS缺陷株甲基循环通路的恢复构建

目的:以变异链球菌LuxS缺陷株为模型,构建其密度感应缺陷的甲基循环恢复株。方法:以LuxS为阳性表达对照,通过在变异链球菌LuxS缺陷株中异源表达SahH,实现其代谢通路的恢复构建。通过Western印迹、反转录PCR和信号分子AI-2分泌检测,验证目的蛋白的表达。采用SAS8.0软件包对数据进行统计学分析。结果:Western印迹检测2种蛋白在大肠杆菌中均得到正确表达,验证了克隆载体的正常表达能力;反转录PCR验证了变异链球菌LuxS缺陷株中luxS及sahH mRNA的存在;发光实验证实LuxS阳性表达对照株AI-2的分泌能力恢复。结论:成功构建变异链球菌LuxS缺陷的代谢恢复株,为探讨LuxS的调控机制提供了分子生物学工具及实验对照。

变异链球菌luxS基因敲除重组质粒的构建

目的:构建一个含有抗卡那霉素基因和变异链球菌luxS基因上下游区同源序列的重组质粒,以便以后转化入变异链球菌进行luxS的敲除。方法:设计引物,以质粒pEGFP-N1为模板,进行PCR得到抗卡那霉素的DNA片断,再以变异链球菌的DNA为模板,PCR得到luxS基因上下游序列,最后将这3段DNA片断分别按顺序插入到pMD19-T载体的多克隆酶切位点中,转化大肠杆菌的感受态中,通过在卡那霉素和氨苄青霉素的培养基进行筛选。结果:kana+基因和luxS基因两侧同源序列成功连入到pMD19-T载体相应酶切位点,酶切、测序结果正确。结论:成功构建变异链球菌luxS基因敲除重组质粒,为将来构建变异链球菌luxS突变株打下基础。

luxS基因介导乳酸菌益生特性研究进展

一些乳酸菌具有高肠道耐受性、高粘附肠上皮细胞和产具有抑菌活性的细菌素等益生特性。某些乳酸菌的细菌素合成量、耐受性及黏附特性可以被诱导物-2(autoinduction-2,AI-2)提高,AI-2是通过甲基循环合成的一种信号分子。lux S基因可以编码合成Lux S蛋白,而Lux S蛋白是AI-2合成的关键酶,因此展开对lux S在细菌素合成量和耐受性、黏附特性方面的作用研究具有重要意义。该文通过讨论lux S基因在乳酸菌益生特性的研究现状,提出该研究领域中存在的问题以及发展趋势,从而为提高乳酸菌的益生特性提供理论依据。