Exendin-4与绿色荧光蛋白融合基因的表达与活性研究

目的:表达具有双功能特性的Exendin-4-GFP融合蛋白。方法:构建融合表达载体pET21a(+)/Exendin-4-GFP,转化大肠杆菌BL21后,以IPTG诱导融合蛋白的表达,并利用镍金属螯合层析树脂对其进行纯化。采用胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)转染的CHO细胞考察融合蛋白的结合特性,并检测其生物活性。结果:含有融合表达载体的重组菌株诱导表达后,经SDS-PAGE及免疫印迹分析显示,31.0ku的融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达,且具有Exendin-4的抗原活性。受体结合实验表明,该融合蛋白能够与GLP-1R特异性结合,在488nm激发光下呈现绿色荧光。体内活性实验表明,融合蛋白具有明显的降血糖活性。结论:本研究表达的Exendin-4-GFP融合蛋白同时具有Exendin-4的活性和荧光特性,为研究GLP-1受体功能以及Exendin-4与细胞相互作用的机制奠定了基础。

人内皮高表达脂多糖相关因子1蛋白亚细胞定位研究

目的 了解人内皮高表达脂多糖相关因子1（EOLA1）蛋白在内皮细胞中的亚细胞定位情况.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞株ECV304,另构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）-EOLA1融合蛋白表达质粒.用脂质体分别将空质粒pEGFP-N2和融合蛋白表达质粒EGFP-EOLA1转染入ECV304细胞.继续培养48 h,取细胞,用蛋白质印迹法鉴定EGFP及EGFP-EOLA1融合蛋白的表达;采用激光共聚焦显微镜和免疫电镜技术,观察细胞中EOLA1蛋白的亚细胞定位情况.结果 经酶切和测序鉴定证实重组质粒EGFP-EOLA1构建成功.蛋白质印迹法检测结果显示,EGFP和EGFPEOLA1融合蛋白在转染细胞中成功表达.激光共聚焦显微镜下见转染空质粒的ECV304,绿色荧光遍布整个细胞,但无细胞核聚集现象;转染融合蛋白表达质粒的ECV304,绿色荧光也呈全细胞分布,且在胞核内明显聚集.透射电镜下见转染空质粒的细胞内无免疫沉积物,转染融合蛋白表达质粒的细胞质基质中有免疫沉积物.结论 EOLA1蛋白定位在ECV304细胞核与细胞质基质中,作为信号转导因子发挥作用.

重组质粒pEGFP-C3-caveolin-1构建及在小鼠足细胞中的表达

目的:构建真核表达重组质粒pEGFP-C3-caveolin-1及稳定转染小鼠足细胞。方法:用RT-PCR法扩增小鼠肾脏caveolin-1的开放阅读框(ORF),构建TA克隆,用EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位点亚克隆至真核表达质粒pEGFP-C3中,酶切和测序鉴定。脂质体转染法转染小鼠足细胞,荧光显微镜下动态观察转染后荧光蛋白的表达,培养72 h后,加入选择性抗生素G418(400 mg/L)筛选稳定转染细胞株。RT-PCR及Western-blot检测caveolin-1mRNA及蛋白表达。结果:重组质粒pEGFP-C3-caveolin-1经用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切,产生0.56 kb的目的插入片段及4.7 kb的载体片段,经DNA测序鉴定证实0.56 kb的插入片段与小鼠来源的caveolin-1 ORF序列一致;重组质粒转染小鼠足细胞后8 h在荧光显微镜下观察到绿色荧光,12 h后荧光表达逐渐增多;RT-PCR及Western-blot检测稳定转染细胞的caveolin-1 mRNA及蛋白表达水平为对照细胞的约2-3倍(P<0.05)。结论:重组pEG-FP-C3-caveolin-1真核表达载体包含小鼠caveolin-1完整ORF,稳定转染小鼠足细胞为后续相关研究奠定基础。

Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒的构建及其在人肺癌细胞中的表达

目的构建胞内病原体抗性基因1(Ipr1)和绿色荧光蛋白(GFP)基因真核共表达穿梭质粒,并在人肺腺癌细胞A549中表达。方法采用PCR方法,分别从质粒pEGFP-C1-Ipr1和pEGFP-C1中扩增Ipr1和GFP基因,将GFP基因、分枝杆菌复制子OriM和Ipr1基因同时克隆入多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,构建pBud-GFP-OriM-Ipr1穿梭质粒,脂质体法转染A549细胞,荧光显微镜观察GFP的表达,免疫组化方法检测Ipr1蛋白的表达。结果酶切和测序分析表明,pBud-GFP-OriM-Ipr1真核共表达穿梭质粒构建正确。转染A549细胞后,荧光显微镜下可观察到转染细胞中有GFP表达,免疫组化法可检测到Ipr1蛋白的表达,且定位于细胞核内。结论已成功构建Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒,为进一步研究Ipr1抗结核的功能奠定了基础。

pHIF-1α/EGFP-C2质粒的构建与鉴定

目的构建pHIF-1α/EGFP-C2真核细胞表达质粒载体。方法缺氧培养与化学性缺氧两种方法诱导A498人肾癌细胞中HIF-αmRNA水平升高。RT-PCR法扩增HIF-1α的cDNA片段,经T-A克隆扩增后,连接入pEGFP-C2质粒。结果缺氧培养的A498人肾癌细胞组出现HIF-1α的cDNA扩增条带,DNA测序结果Genebank所公布的HIF-1α序列(NM001530)相同,无突变和移码。转染pHIF-1α/EGFP-C2的细胞中检测到HIF-1α蛋白的表达。结论 pHIF-1α/EGFP-C2真核细胞表达质粒构建成功。

具有双层结构和负电荷屏障载体的构建及其基因转染

用组氨酸分别修饰聚乙烯亚胺（PEI）和透明质酸,得到了聚乙烯亚胺-组氨酸（PEI-His）和透明质酸-组氨酸（HA-His）。然后将PEI-His与增强型绿色荧光蛋白质粒DNA（p EGFP-N1）复合形成PEI-His/DNA复合物（PD复合物）,并进一步在其表面吸附HA-His形成具有双层结构和负电屏障的（PEI-His/DNA）/HA-His复合物（HPD复合物）,用于基因传递研究。透射电镜观察到HPD复合物为球形纳米粒子,水化后平均粒径约为142 nm,ζ电位为-28.9 m V。HPD复合物中加入10%胎牛血清后平均粒径为135 nm,ζ电位为-25.8 m V,提示其具有良好的血清稳定性。HPD复合物对p EGFP-N1的包载效率为（91.9±1.15）%,并可有效保护DNA不被DNase I降解。在PEI浓度5~20μg/ml范围内,HPD复合物的细胞毒性明显低于PEI/DNA复合物,前者细胞存活率可维持在80%以上;同时,它可介导DNA进入细胞实现基因转染,转染效率为2.88%。