ST11肺炎克雷伯菌QL5株携带的质粒pQL5-NDM-KPC的研究

目的探讨肺炎克雷伯菌QL5株携带编码碳青霉烯酶基因的质粒及其特性。方法基于二代Illumina和三代Nanopore测序技术平台获得菌株的基因组和质粒序列,然后用一系列软件分析菌株的生物学信息。S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳、质粒液相接合试验和稳定性试验检测菌株携带的质粒特性。结果生信分析显示:肺炎克雷伯菌QL5株携带的bla_(NDM-1)和bla_(KPC-2)基因位于同一个IncC/IncFII(PHN7A8)/IncR杂合质粒上(命名为pQL5-NDM-KPC);QL5株携带的pQL5-NDM-KPC可发生bla_(NDM-1)基因所在区域的片段丢失。结论经检索,携带bla_(NDM-1)和bla_(KPC-2)基因位于同一个IncC/IncFII(PHN7A8)/IncR杂合质粒pQL5-NDM-KPC(GenBank序列号:OR253888)上,为国内外首次报道。

首次从湖南猪源大肠杆菌中检出mcr-1阳性IncI2(Delta)质粒

近年来,由于抗生素耐药基因的广泛传播及多重耐药细菌的出现,导致抗生素的使用面临严峻挑战,致使毒性较强的多黏菌素又重新引起业界的重视,为此对多黏菌素耐药情况的研究也变得十分重要。为了调查畜牧场中多黏菌素耐药基因mcr-1的流行情况,本研究选择我国湖南省某猪场240份肠肛拭子样品,培养分离鉴定出含有mcr-1耐药基因的大肠杆菌菌株,选取多黏菌素等10种抗菌药物对分离的菌株进行耐药性试验,对所有含mcr-1耐药基因的大肠杆菌阳性株进行全基因组测序(whole-genome sequencing,WGS),采用多位点序列分型(multi-locus sequence typing,MLST)技术进行大肠杆菌的遗传多样性分析。研究结果表明,在分离出的172株大肠杆菌中,来自不同个体的9株携带mcr-1基因的大肠杆菌均表现出多重耐药现象;MLST分析共鉴定出ST10、ST196、ST46和ST5229共4种分型和4种血清型(O83:H5,O16:H7,O16:H51,O9:H4)。生物信息学分析显示,所有阳性菌株均未发现与mcr-1基因传播有关的典型可移动遗传元件ISApl1,但均检出可能会导致mcr-1传播的IV型分泌系统基因。质粒接合转移试验与单倍型的MLST多态性结果表明,mcr-1基因主要以质粒介导的水平传播为主。本研究是国际上首次在猪源细菌中检出常见于人医临床细菌的携带有mcr-1抗性基因的IncI2(Delta)质粒。

pLKO.1-ZNF703 shRNA质粒的构建与鉴定

目的构建pLKO.1-ZNF703 shRNA质粒靶向敲低ZNF703。方法根据人和鼠ZNF703基因序列中的外显子区在RNA干扰平台上(broadinstitute.org)设计shRNA的靶向序列,并根据pLKO.1中Age I和EcoR I酶切位点序列设计并合成ZNF703 shRNA的引物;对引物进行退火;将pLKO.1质粒进行酶切、胶回收;用T4酶进行连接、转化、涂板,对阳性克隆菌落PCR鉴定和测序鉴定;将构建好的质粒利用慢病毒包装并转染HCT-116细胞系,Q-PCR检测ZNF703的敲低效率。结果成功构建pLKO.1-ZNF703 shRNA质粒,并且利用病毒包装体系构建ZNF703 shRNAHCT-116细胞系,RT-PCR结果显示设计并构建的pLKO.1-ZNF703 shRNA质粒可用于有效敲低ZNF703。结论成功构建可用于有效敲低人或鼠源细胞系中ZNF703的pLKO.1-ZNF703 shRNA质粒。

弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒免疫小鼠后的免疫应答

目的： 用构建的弓形虫ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 真核表达重组质粒， 直接免疫小鼠， 观察其所诱导的细胞及体液免疫反应。方法： 碱裂解法大量制备ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒， 经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠， 每鼠注射１００ μｇ，２ ｗ ｋ 后同量加强免疫１ 次， 以ｐｃＤＮＡ３ 空质粒及生理盐水组为对照。分别于免疫后３０ ｄ、５０ ｄ、７０ ｄ 共３ 次用ＭＴＴ 法测定小鼠脾脏Ｔ 淋巴细胞增殖活性及ＮＫ 细胞活性； 用间接免疫荧光抗体法测定Ｔ淋巴细胞亚群数目；ＥＬＩＳＡ 法测定ＩｇＧ 抗体滴度。结果： 用ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒免疫小鼠３０ ｄ 后， 脾脏明显增大； 免疫组脾淋巴细胞增殖活性明显高于生理盐水及空质粒对照组。ＮＫ 细胞杀伤活性３ 次的测定结果免疫组均高于对照组。Ｔ 细胞亚群， ＣＤ４＋ 细胞数与对照组相比较无明显变化， 而ＣＤ８＋ 细胞数显著增高。血清抗体ＩｇＧ７０ ｄ 内检测结果， 与对照组相比较， 无明显增高； 而免疫后９０ ｄ 检测明显增高， 抗体滴度１∶１００。结论： 用ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 重组质粒ＤＮＡ免疫小鼠， 可诱导产生细胞及体液免疫应答。

基于pSPORT1质粒的转基因小鼠家系的建立

目的：建立在基因组中整合有ｐＳＰＯＲＴ１质粒的转基因小鼠家系，为体内基因突变研究提供有效的动物模型。

ABCE1基因siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建针对人ABCE1基因siRNA表达质粒,为进一步研究该基因功能奠定基础。方法:合成含靶向ABCE1基因siRNA转录模板的茎环结构,与两端分别有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒连接,大肠杆菌中扩增,测序鉴定。结果:转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,重组质粒电泳初步说明质粒构建成功,测序结果表明RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express的酶切位点BamHⅠ、HindⅢ之间有71bp的插入片段,其序列与所设计、合成的ABCE1的siRNA转录模板序列一致。结论:siRNA转录模板完整正确地插入RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒中。

重组质粒pLMP1-p53mt在人鼻咽癌HNE1和人宫颈癌HeLa细胞中的表达分析

目的:研究重组质粒pLMP1-p53mt中EB病毒LMP1基因和突变型p53(p53mt)基因在HNE1和HeLa细胞中的体外表达。方法:体外培养人鼻咽癌细胞株HNE1和人宫颈癌细胞株HeLa,采用脂质体lipofectAMINETM2000介导将重组质粒pLMP1-p53mtDNA转染细胞,利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Sourthernblot法分析p53mt基因和LMP1基因的表达情况。结果:经重组质粒pLMP1-p53mt转染的HNE1和HeLa细胞中检测到了p53mt基因和LMP1基因的表达。结论:重组质粒pLMP1-p53mt的LMP1基因和p53mt基因能分别在EDL-2启动子和CMV启动子控制下表达。该质粒可进一步用于转基因动物的制备和基因功能研究。

弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅰ.pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫ＺＳ２株ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１真核表达重组质粒，为进一步表达及ＤＮＡ免疫做准备。方法用ＰＣＲ技术从弓形虫ＺＳ２分离株的基因组ＤＮＡ中扩增编码棒状体蛋白１（ＲＯＰ１）的基因片段，重组入ｐＵＣ１８克隆载体。将ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１中的ＲＯＰ１外源基因片段经酶切、连接等反应，亚克隆入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体，再经含氨苄ＬＢ培养基筛选，酶切、ＰＣＲ鉴定。结果从ＺＳ２株基因组ＤＮＡ中扩增出特异的ＲＯＰ１基因片段，克隆成功ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１；经亚克隆，筛选鉴定获得了ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１重组质粒。结论构建成功弓形虫ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１重组质粒，亚克隆成功ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１重组质粒。

鸡堆形艾美球虫3-1E基因真核表达质粒的构建及其抗球虫免疫保护作用

应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从堆形艾美球虫SH株子孢子中扩增3-1E基因片段,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-3-1E。质粒纯化后体外转染293T细胞,通过间接免疫荧光技术和免疫组织化学技术检测3-1E蛋白在转染细胞中的表达情况。将构建的重组质粒以及空载体质粒分别于14、21日龄分2次经腿部肌肉注射免疫SPF雏鸡,28日龄除非免疫非感染对照组外各组攻击性感染5×104个堆形艾美球虫孢子化卵囊,观察真核表达质粒对球虫感染鸡的免疫保护作用并探讨其免疫保护机理。结果显示,与载体对照组相比,质粒pcDNA3.1(+)-3-1E 2次免疫后可显著提高脾CD8+T淋巴细胞亚型数量,并具有一定的抗球虫免疫保护作用,可显著减少每克粪便的卵囊排出量,降低十二指肠病变记分,减少增重下降等。

pcDNA3.1-HMOX1重组质粒载体的构建与鉴定

目的构建pc DNA3.1-HMOX1重组质粒载体。方法使用基因合成法合成HMOX1基因,在其N端添加Kozak序列及His标签序列,将扩增后的目的基因双酶切连接至pc DNA3.1载体的Bam HⅠ和NotⅠ之间。转化DH5α大肠杆菌后,挑取阳性克隆子进行质粒抽提电泳及测序鉴定。结果 p CDNA3.1-HMOX1重组质粒经酶切电泳及DNA测序证实,目的基因HMOX1的序列完全正确,重组质粒载体构建成功。结论成功构建p CDNA3.1-HMOX1融合基因并在DH5α大肠杆菌内表达,为进一步探讨HMOX1的生物学功能奠定了基础。

转化生长因子β_1启动子质粒重组体的构建及活性研究

目的探讨调控TGF-β1基因高水平转录的启动片段。方法:以人基因组DNA为模板,PCR扩增获得TGF-β1基因转 录起始位点上游5′端-1328～+812bp的片段中不同长度的片段,以此作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因 的质粒pCAT3-enhancer重组成5个重组体,并将其转染至大鼠肝星状细胞株中,测定细胞的CAT的表达水平并比较各重组体 的启动子活性。结果:-308～+812bp序列具有较强的启动活性,-611～+812bp次之,其他几个重组体的启动活性从高到 低的排序依次为-1328～+812bp、-867～+812bp、+227～+812bp。结论:TGF-β1基因启动子片段中,-308～+812bp、 -611～+812bp、-1328～+812bp重组体具有较强的启动活性,是进一步研究人TGF-β1基因转录调控的重要靶序列。

重组DKK1及pCMV-HA2/DKK1重组质粒对宫颈癌细胞体外增殖作用的影响

目的观察人重组DKK1和pCMV-HA2/DKK1重组质粒对体外培养宫颈癌细胞株Hela细胞增殖的影响。方法体外培养Hela细胞,非放射性细胞增殖(MTS)法检测重组DKK1、抗DKK1抗体和人源DKK1真核表达质粒pCMV-HA2/DKK1对Hela细胞增殖作用的影响,western blot及ELISA法检测转染pCMV-HA2/DKK1重组质粒后Hela细胞中DKK1蛋白的表达情况。结果与对照组相比,10,50 ng/mL的DKK1对Hela细胞有明显抑制作用(F分别为162.31,184.65,P均<0.01);抗DKK1抗体对Hela细胞的增殖影响无统计学意义(P均>0.05);pCMV-HA2/DKK1重组质粒转染Hela细胞后对细胞增殖有明显抑制作用,加入抗DKK1抗体不能完全拮抗pCMV-HA2/DKK1对Hela细胞的抑制作用;pCMV-HA2/DKK1重组质粒转染Hela细胞后可检测到DKK1蛋白表达,经western blot证实为DKK1蛋白(Mr约为38 000),ELISA法结果表明,DKK1蛋白的分泌量随培养时间的延长而增加,第5天时达峰值(19.82 mg/L)。结论重组DKK1和人源DKK1真核表达质粒pCMV-HA2/DKK1可抑制Hela细胞的增殖,抗DKK1抗体可部分抵抗DKK1的抑制作用,提示DKK1在宫颈癌肿瘤发生中对肿瘤细胞具有抑制作用。

p27Kip1基因shRNA表达质粒的构建鉴定及功能研究

目的构建细胞周期性激酶抑制剂p27Kip1的小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,并观察其对牛角膜内皮细胞增殖能力的影响。方法设计有发夹状结构的3条p27Kip1-shRNA对应模板DNA序列,并构建无关序列HK-shRNA作为阴性对照。转入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的pGenSil-1质粒,构建重组质粒pGenSil-1/p27Kip1-1、pGenSil-1/p27Kip1-2、pGenSil-1/p27Kip1-3、pGenSil-1/HK。转化DH5α菌株,提取质粒行酶切及测序鉴定。以脂质体法将4个重组质粒分别导入牛角膜内皮细胞。转染后48h以Western blot法检测p27Kip1蛋白水平及MTT法检测各实验组和对照组细胞增殖情况。结果酶切及测序证实4个重组质粒均构建成功。3个实验组p27Kip1蛋白水平分别下降了66.41%、61.51%、71.32%,shRNA可显著促进牛角膜内皮细胞增殖。结论成功构建了针对p27Kip1的RNA干扰表达载体。

假单胞菌XN-1硝基苯降解性质粒的提取及研究

假单胞菌XN 1对有机污染物硝基苯具有降解性 ,并且对氨苄青霉素具有抗性。检测和提取了假单胞菌XN 1细胞内的质粒 ,得到了一个约 2 2kb大小的质粒pXN 1。质粒消除实验证实这个质粒与硝基苯降解性有关 ,而与抗生素抗性无关。XN 1和其自发突变株XN 1 2和XN 1 3特性的差异和质粒检测的差异之间存在对应关系 ,并且得到了一个比 pXN 1小几个kb的衍生质粒 pXN 1 3。

全国10所教学医院产ESBLs和质粒AmpC酶大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌的研究

目的研究全国10所教学医院临床分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中同时产ESBLs及质粒型AmpC酶菌株的比率及其基因型特点,比较不同地区间的差别。方法收集来自中国不同地区的10所教学医院2003年度产ESBLs的大肠埃希菌90株和肺炎克雷伯菌61株,用等电聚焦电泳测定β内酰胺酶的等电点;接合试验证实酶基因有无可转移性;采用多重聚合酶链反应(MPCR)及序列分析确定质粒AmpC酶的基因型。结果武汉、南京、济南等地产ESBLs大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌所占比率相近,均在50%左右;北京产ESBLs大肠埃希菌所占比率低于肺炎克雷伯菌;其他各城市产ESBLs大肠埃希菌所占比率均略高于肺炎克雷伯菌。在产ESBLs菌株中24.4%大肠埃希菌和19.4%肺炎克雷伯菌对头孢西丁耐药。除沈阳无对头孢西丁耐药菌株外,其他医院均存在对头孢西丁耐药株。产ESBLs菌株基因型主要为CTX—M型,其中以CTX-M-9组最为常见,其次为CTX-M-1组。在同时产ESBLs和AmpC的菌株中,肺炎克雷伯菌多于大肠埃希菌,且均为CTX-M/ DHA-1型(多为CTX-M-9/DHA-1型)。3株同时产ESBLs和AmpC肺炎克雷伯菌的接合子PCR结果与其供体菌完全相同。结论参与本研究的各所教学医院产ESBLs菌株基因型主要为CTX-M-9组,在同时产ESBLs和AmpC酶的菌株中,肺炎克雷伯菌多于大肠埃希菌,多为CTX-M-9/DHA-1型,该酶可通过质粒传播。

pEGFP-N1质粒转染乳鼠心肌细胞的分布及效率

目的 :研究 pEGFP N1质粒转染心肌细胞的分布及效率。 方法 :培养乳鼠心肌细胞 ,根据乳鼠心肌细胞的不同生长时间 (1～ 3d)进行 pEGFP N1质粒转染心肌细胞的实验研究。 结果 :乳鼠心肌细胞生长 1d时 ,pEGFP N1质粒转染心肌细胞的效率显著高于乳鼠心肌细胞生长 2d、3d时 ;pEGFP N1质粒转染心肌细胞后EGFP均匀地充满胞浆和胞核。结论 :pEGFP N1质粒转染乳鼠心肌细胞的效率与心肌细胞的生长期有关 ;EGFP在心肌细胞中均匀分布于胞浆和胞核。

pcDNA3.1(+)/caveolin-1真核表达质粒的构建及其在MCF-7乳腺癌细胞株中的表达

目的明确正常组织和人乳腺癌细胞株MCF-7中caveolin-1的表达情况,构建pcDNA3.1(+)/caveolin-1表达质粒,并鉴定其表达。方法 RT-PCR法检测9种正常人体组织及人乳腺癌细胞株MCF-7中caveolin-1基因的扩增情况;Western blotting法检测MCF-7细胞中caveolin-1蛋白的表达情况。设计克隆引物和表达引物,RT-PCR法扩增caveolin-1基因,用EcoRⅠ+XbaⅠ内切酶消化回收PCR产物和质粒pcDNA3.1(+),连接后构建pcDNA3.1(+)/caveolin-1重组表达质粒。挑选pcDNA3.1(+)/caveolin-1转染感受态细菌后的单菌落进行PCR鉴定,阳性菌落培养后提取质粒行酶切鉴定及测序鉴定。瞬时转染MCF-7细胞后Western blotting检测caveolin-1蛋白的表达情况。结果①9种正常组织中均有caveolin-1基因扩增,MCF-7细胞中无caveolin-1基因扩增且无蛋白表达;②pcD-NA3.1(+)/caveolin-1重组表达质粒转染MCF-7细胞后caveolin-1蛋白表达良好。结论成功构建了pcDNA3.1(+)/caveolin-1重组表达质粒,瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞后caveolin-1表达稳定。

蓝藻Synechococcus sp.PCC 7942穿梭表达质粒的构建及胸腺素α_1基因的表达

利用本实验室构建的含蓝藻Plectonema boryanum内源小质粒的穿梭质粒pPRS-1,改建成含热诱导启动子、泛素融合的胸腺素α_1(UB-Tα_1)目的基因、卡那霉素抗性选择标记、rbcs终止子的新的穿梭表达重组质粒pPRFUT。将这种重组质粒转化蓝藻Synechococcus sp.PCC7942,通过抗性筛选获得了具卡那霉素抗性的转化藻株。经Southern-blot杂交证实,穿梭表达质粒已转入蓝藻Synechococcus sp. PCC7942细胞中;在42℃热诱导30min后,目的基因UB-Tα_1得到较高水平表达,表达量约占总蛋白量的7.5%。

细菌NDM-1质粒耐药表型与其表达的相关性研究

目的探讨NDM-1质粒携带菌株耐药表型与其基因表达的相关性,为临床抗菌药物选择提供理论参考。方法携带NDM-1的质粒电转化入大肠埃希菌TOP10,采用琼脂平板倍比稀释法测定碳青霉烯类药物对野生株和电转化子的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),TaqMan RT-PCR检测碳青霉烯类耐药菌株的blaNDM-1基因表达及亚-MIC亚胺培南诱导对blaNDM-1基因表达的影响。结果12株产NDM-1菌株中共有8株电转化成功,电转化子对碳青霉烯类药物的耐药性与野生菌株基本一致。细菌对碳青霉烯类的耐药性与blaNDM-1基因表达成正比。亚-MIC亚胺培南诱导后菌株对碳青霉烯类药物的MIC值和blaNDM-1基因表达均显著高于野生株。结论碳青霉烯类耐药菌株耐药表型与blaNDM-1基因表达具有正相关性,TaqMan RT-PCR检测可快速准确地为临床治疗提供依据。

真核表达质粒pVAX1的应用

从20世纪90年代DNA疫苗诞生以来，其在医学领域已取得长足的进步和发展，它的出现为预防感染性疾病的发生提供了一种新思维、新方法。但是，目前在DNA疫苗中所应用的载体质粒仅局限于实验室研究和动物实验，如何使DNA疫苗应用于人体实验，最终走向临床研究，是摆在当今广大科研人员面前的关键难题。pVAX1的出现为解决这一难题提供了可能，它是由美国食品和药品管理委员会（FDA）推荐的唯一可以应用于人体实验的载体质粒。