农杆菌介导类胡萝卜素合成酶基因LycB转化菊花的研究

以菊花愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法,利用番茄红素β环化酶基因(LycB)对菊花进行转化,以抗性愈伤率为指标,探讨了侵染时间、共培养时间、农杆菌菌液浓度、乙酰丁香酮(AS)浓度等因素对转化的影响,建立了LycB基因转化菊花的遗传转化体系。结果表明:农杆菌侵染菊花愈伤组织的最佳时间为5min;农杆菌菌液浓度OD600值0 55;愈伤组织与农杆菌共培养的时间以3d效果最好;添加AS可提高抗性愈伤率,适宜的AS浓度为100μmol L;采用Hyg浓度由低到高的筛选方式可有效提高抗性愈伤率;PCR分子检测初步证明目的基因LycB已转入菊花愈伤组织中。

枸杞中番茄红素β-环化酶基因(LycB)的分离

以宁夏枸杞叶片为材料,采用异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取完整的总RNA,利用PolyATractmRNA Isolation System(Promega公司)分离mKNA,然后利用Universal Riboclone RcDNA SynthesisSystem(Promega公司)合成双链cDNA,在cDNA末端连接上EcoR Ⅰ接头,并与λExCell载体连接,利用Packagene Lambda DNA Packaging System进行包装,在国内外首次构建出滴度为2.78×10 5pfu／ml,重组效率为88.1％的枸杞叶片cDNA文库。用Digoxigenin(DIG)标记龙胆草LycB探针,并对枸杞叶片cDNA文库进行筛选,获得5个LycB cDNA阳性克隆。释放质粒后,进行酶切鉴定,LycB阳性克隆cDNA插入片段的大小为2.1kb左右。为利用基因工程手段来调控类胡萝卜素的生物合成奠定了基础。

农杆菌介导类胡萝卜素合成酶基因LycB转化水稻的研究

以3个水稻品种成熟胚诱导的良好胚性愈伤组织为受体,以LycB为目的基因,应用根癌农杆菌介导法对水稻进行遗传转化,同时以抗性愈伤率为依据,对影响转化的几个因素进行优化研究。结果表明,预培养4d、侵染5-10min、农杆菌菌液浓度OD600值0.7-1.0、共培养2d有利于提高转化率。经潮霉素筛选获得的抗性植株经PCR和PCR-Southern分析鉴定,初步证明外源基因LycB已整合到水稻的基因组中。

杜氏盐藻LYCB基因克隆及在盐胁迫下的表达分析

[目的]为探究杜氏盐藻(Dunaliella Salina)富集β-胡萝卜素的分子机理。[方法]本文选用从运城盐湖分离的杜氏盐藻株系Ds-YC011为试材,克隆编码番茄红素-β-环化酶(lycopene b-cyclase,LYCB)的基因(DsLYCB)并分析其功能。[结果]DsLYCB基因cDNA全长1 910bp,开放阅读框(ORF)长1 769bp,编码584个氨基酸。生物信息学分析显示,DsLYCB为不稳定亲水性蛋白,无跨膜结构,定位于叶绿体。蛋白二级结构中α-螺旋结构占39.9%,杜氏盐藻DsLYCB蛋白与雨生红球藻亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,在高盐(3mol·L^(-1))胁迫下,DsLYCB基因表达量显著上升,胁迫4h时表达量达峰值,为正常对照(1.5mol·L^(-1))条件下的2倍。高盐(3mol·L^(-1))胁迫下,DsLYCB基因上调表达模式与藻细胞类β-胡萝卜素积累增加相一致,预示着DsLYCB在杜氏盐藻类β-胡萝卜素合成积累中起重要作用。[结论]这为解析微藻类胡萝卜素合成调控机制及遗传修饰提供了科学依据。

中国水仙花色相关基因的克隆与分析

【目的】克隆并初步分析与中国水仙花色发育相关的八氢番茄红素合成酶(PSY)、八氢番茄红素脱氢酶(PDS)和番茄红素β-环化酶(LycB)等3个酶基因序列及结构,了解其花色形成的分子机制,为进一步研究中国水仙类胡萝卜素代谢基因工程奠定基础。【方法】以中国水仙花瓣的mRNA为模板,采用RT-PCR技术扩增PSY、PDS和LycB等3个关键酶基因的保守序列,并进行序列结构分析。【结果】分离得到的中国水仙PSY、PDS和LycB的保守序列长度分别为343、500和486bp,分别编码112、166、161个氨基酸。基因比对结果表明,推导氨基酸序列与已知其他不同植物均具有较高同源性,分别为76.5%～96.1%、69.8%～98.3%和77.3%～95.5%,且包含PSY、PDS和LycB酶的相关功能结构域,初步证明为目标基因,不同物种间的PSY、PDS和LycB基因具有相当高的保守性。编码蛋白预测结果发现,PSY、PDS和LycB虽然有部分疏水区域,但是不存在明显的跨膜结构域。【结论】研究结果为进一步了解中国水仙花色相关酶基因的调控功能及花瓣着色机理奠定分子基础。

根癌农杆菌介导的番茄遗传转化

利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA101携带LycB基因(番茄红素β-环化酶)和潮霉素抗性基因,以东农704、708、709三个番茄品种的子叶、茎段为转化受体对番茄进行遗传转化,经PCR分子检测初步证明,目的基因LycB已整合进番茄基因组中。