不同月龄牦牛睾丸中LYZL4、LYZL6的基因表达及蛋白质定位

为探讨人源类溶菌酶蛋白4(Human lysozyme-like protein4,LYZL4)和人源类溶菌酶蛋白6(Human lysozyme-like protein 6,LYZL6)在牦牛睾丸中的表达机制,分别选取6、18、30、72月龄健康的牦牛12头(每组3头)采集睾丸组织。应用qRT-PCR、Western-blot和免疫组化技术分别分析了LYZL4和LYZL6在不同月龄牦牛睾丸中的表达和定位。结果显示,在不同月龄牦牛睾丸中均检测到 LYZL4、LYZL 6 基因和相关蛋白质的表达,其基因表达量随着牦牛月龄增加呈现上升趋势。72、30月龄牦牛睾丸中 LYZL4、LYZL 6 基因及蛋白质的表达量极显著高于6月龄和18月龄牦牛( P < 0.01)。LYZL4蛋白在6月龄牦牛睾丸中定位于间质细胞内,在18月龄牦牛睾丸中主要定位于精原细胞和支持细胞内,在30、72月龄牦牛睾丸中定位于圆形精子细胞内。而LYZL6蛋白在6月龄牦牛的睾丸中定位于间质细胞内,在18月龄牦牛睾丸中主要定位于精原细胞内,在30、72月龄牦牛睾丸中定位于圆形精子细胞和初级精母细胞内。 LYZL4和LYZL 6 基因主要在牦牛性成熟后高丰度表达,而在性成熟前相对低丰度表达。因此,在牦牛雄性生殖系统的发育过程以及在精子发生的调控过程中LYZL4和LYZL6均发挥着重要的作用。

人源溶菌酶基因LYZL4在毕赤酵母中的重组表达及活性测定

LYZL4是本实验室克隆的一种c型人溶菌酶基因,根据毕赤酵母密码子偏爱性对LYZL4基因进行优化设计,优化后的基因克隆至具有乙醇氧化酶启动子(AOX1)的pPIC9K载体中。通过电转化方法整合到甲醇营养型毕赤酵母表达菌株GS115基因组上,再利用不同浓度梯度的G418抗性YPD固体培养基筛选高拷贝转化子,经摇瓶发酵后,其上清液在SDS-PAGE胶上14.4 kDa处出现明显的蛋白条带,该蛋白条带经质谱鉴定证实是人LYZL4蛋白。以人溶菌酶(164 071U/mg)作为标准品,使用艳红微球菌作为底物,通过比色法测定重组LYZL4溶菌酶蛋白的活性,结果显示重组人溶菌酶LYZL4蛋白具有明显的溶菌活性,其酶活力可达38893U/ml。