同时高产甘露聚糖肽与乳酶生发酵条件的研究

[目的]探索同时高产甘露聚糖肽和乳酶生的最佳发酵条件。[方法]以甲型溶血性链球菌H1S-33号为菌株,进行液体发酵培养,在各个时间段分别取样测定活菌数及甘露聚糖肽含量,确定最佳培养条件。[结果]在液体发酵过程中,28h发酵液中甘露聚糖肽含量最高为69.2μg/ml,活菌数最多为2.38×1016个/ml。[结论]同时高产甘露聚糖肽与乳酶生发酵条件为:培养基由牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、氯化钠组成,发酵温度37℃,最佳发酵时间28h。

乳酶生生产用菌种的全基因组序列分析研究

目的了解我国乳酶生的生产用菌种全基因组分子特征。方法将乳酶生的生产用菌种屎肠球菌CMCC32901培养后,依次进行形态观察、生化鉴定与16S rRNA基因序列测定,并应用高通量测序技术,对生产用菌种CMCC32901进行全基因组序列测定,分析基因组基本特征、基因功能、同源性及致病性。结果分析结果显示,发现CMCC32901菌株与NCBI数据库中收录的不同屎肠球菌菌株的16Sr RNA基因序列相似度大于99.5%,与其他肠球菌菌株之间的16S rRNA基因序列相似度均大于92.0%。屎肠球菌CMCC32901染色体全基因组序列全长为2 394 726 bp,平均GC含量为39.1%,共含有2718个基因,其中具有COG功能2059个,参与KEGG代谢通路1402个。同源性分析显示其基因组中编码2589个屎肠球菌特异性蛋白。细菌的致病性预测分析发现在CMCC32901菌株中发现5种对人潜在致病性相关蛋白。结论首次获得了我国乳酶生生产用菌种——屎肠球菌CMCC32901全基因组的基本特征,为后续乳酶生的生产工艺优化和生产用菌种的质量控制奠定了基础。

微生态制剂Sylvam exam治疗婴幼儿轮状病毒肠炎的临床研究

目的:为评估Sylvam exam 治疗婴幼儿急性腹泻的疗效。方法:在小儿轮状病毒腹泻流行期间,选择该病住院患儿,分为Sylvam exam 及乳酶生两组各 30 例进行对比研究。两组的性别、年龄、病情相似。两组都做了HRV-RNA 病毒检测(PAGE 法),阳性率分别为76.67% 和83.33% ,无显著性差异(P> 0.05)。结果:Sylvam exam (治疗组)与乳酶生(对照组)总有效率为86.67% 和53.33% (P< 0.05),治疗组优于对照组。在HRV- RNA 阳性的病例中:治疗组为23 例,对照组为25 例,其总有效率分别为86.96% 和52.00% ,治疗组也优于对照组(P< 0.05)。两组治疗后的止泻平均时间分别为3±1.34 天和4.27±0.89 天,治疗组也优于对照组(P< 0.05)。结论:Sylvam exam

乳酶生片联合达克宁栓治疗复发性念珠菌性阴道炎疗效观察

目的观察乳酶生片联合达克宁栓治疗复发性念珠菌性阴道炎疗效。方法300例复发性念珠菌性阴道炎患者随机、单盲分为治疗组150例和对照组150例，对照组采用达克宁栓200mg，阴道上药，每晚一次，共用7天。治疗组在对照组的基础上加用乳酶生片0．6g，每晚一次，共用7-10天。两组用药均每月重复一次，连用3个月。分别于治疗前，治疗后1个月、2个月、3个月进行疗效观察，比较复发情况。结果治疗组总有效率为94．7％，治疗3个月后复发率为5．97％；对照组总有效率为85．3％，治疗3个月后复发率为19．04％，治疗组疗效明显优于对照组（P〈0．01），治疗组各症状复发明显少于对照组（P〈0．05）且治疗组复发率明显低于对照组（P〈0．01）。结论乳酶生片与达克宁栓合用治疗复发性念珠菌性阴道炎效果良好，可明显减少复发。

乳酶生片中乳酸菌的分离鉴定及其增殖培养条件优化

该研究采用传统培养分离法从乳酶生片中分离乳酸菌,通过形态观察、生理生化试验及分子生物技术对其进行鉴定,并采用单因素及响应面试验对其增殖培养条件及培养基进行优化。结果表明,从乳酶生片中分离得到一株乳酸菌Y1,经鉴定为屎肠球菌(Enterococcus faecium),其最适培养条件为初始pH 8.0,生长温度37℃,接种量1%,最优增殖培养基为乳糖11 g/L,乳清粉10 g/L,酵母浸粉22 g/L,硫酸镁0.28 g/L,硫酸锰0.18 g/L。用此培养基培养所得E.faecium Y1的活菌数为2.90×10^(9)CFU/mL,比优化前活菌数提高了80.12%。

60Co-γ射线辐照对复方胰酶散质量影响的研究

目的探讨60Co-γ射线辐照对复方胰酶散中乳酶生含量、杂菌数量、胰蛋白酶和淀粉酶活性的影响。方法检测辐照前后乳酶生含量、杂菌数量、胰蛋白酶和淀粉酶活性。结果经60Co-γ射线辐照(3 kGly,48 h;10 kGly,48 h),复方胰酶散中乳酶生含量、杂菌数量几乎为零,胰蛋白酶活性没有变化,淀粉酶活性平均下降34.9%(n=20)。结论60Co-γ射线辐照不仅杀灭污染微生物,也使乳酶生含量几乎降为零,淀粉酶活性下降,影响复方胰酶散质量和疗效。复方胰酶散不能用60Co-γ射线辐照。

止泻散敷贴神阙穴治疗婴幼儿腹泻随机平行对照研究

[目的]观察止泻散敷贴神阙穴治疗婴幼儿腹泻疗效。[方法]使用随机平行对照方法,将68例住院患者按掷骰子法简单随机分为两组。对照组34例乳酶生,0.3g/次,3次/d。治疗组34例止泻散（肉桂、丁香各9g,白胡椒5g,五倍子12g,石榴皮20g,磨粉,75%酒精调和,外敷神阙穴,代温灸膏固定,贴敷12~24h）,1次/d。连续治疗3d为1疗程。观测临床症状、腹泻、大便性状、不良反应。治疗1疗程,判定疗效。[结果]治疗组痊愈19例,显效13例,无效2例,总有效率97.06%。对照组痊愈14例,显效11例,无效9例,总有效率76.47%。治疗组疗效优于对照组（P〈0.05）。[结论]止泻散敷贴神阙穴治疗婴幼儿腹泻,疗效满意,无严重不良反应,值得推广。

乳酶生质量标准中酸度试验的影响因素探讨

目的:考察乳酶生现行质量标准中酸度试验的影响因素。方法:测定不同来源牛奶、不同接菌量、不同保存条件下的酸度值。结果:采用不同品牌、不同批次牛奶测定的酸度值不稳定;现行质量标准无法真实反映保存条件对样品质量的影响。结论:牛奶培养基的质量问题和现行标准方法欠合理,导致酸度试验结果缺乏可靠性。

乳酶生片及原料质量标准乳酸鉴别试验研究

目的:选用3种市售纯牛奶和2种脱脂奶粉,优选乳酶生质量标准鉴别中乳酸鉴别试验培养基。方法:分别用伊利、银桥、蒙牛3种纯牛奶,完达山和伊利2种脱脂奶粉制备牛奶培养基,比较不同牛奶培养基进行乳酸鉴别试验的结果,为乳酶生质量标准提高提供参考。结果:牛奶培养基对照管均表现为黄色,供试品管表现有黄色、橙黄、淡橙红、橙红与红色,该结果与乳酶生现行标准不符。结论:采用完达山脱脂奶粉制备的牛奶培养基在乳酸鉴别试验中灵敏度最高,其次为伊利脱脂奶粉,3种纯奶在乳酸鉴别中的灵敏度均较低。

乳酶生标准中乳酸鉴别试验的影响因素探讨

目的:考察乳酶生质量标准中乳酸鉴别试验的影响因素。方法:改进现行标准中主要操作步骤,测定不同来源牛奶培养基中乳酸和乳糖的含量。结果:使用不同来源的牛奶培养基,鉴别反应的颜色差异显著;样品稀释倍数由原来的20倍改为5倍后,鉴别反应呈现的颜色最深;未经灭菌处理的牛奶培养基发酵产生的乳酸含量较高,其乳酸鉴别反应颜色最深。结论:牛奶培养基中糖类成分和含量的差异及样品中乳酸浓度是影响乳酸鉴别试验结果判定的主要因素。

复方胰酶散中牛奶凝固力试验的探讨

目的:建立以屎肠球菌活菌的有无和数量作为乳酶生的鉴别方法。方法:采用10-1样品溶液0.2 mL涂布于1%碳酸钙含糖牛肉琼脂培养基上,含屎肠球菌的样品,形成透明钙化圈。结果:用牛奶凝固力试验体现复方胰酶散中乳酶生量,由于胰酶对牛奶凝固力试验有消解作用,凝固现象不明确;用屎肠球菌形成透明钙化圈,直观、明确。结论:复方胰酶散中乳酶生的鉴别,采用屎肠球菌形成透明钙化圈方法代替牛奶凝固试验,方法简单,结论明确。

基于基因功能分析的乳酶生与表飞鸣生产用菌株质量比对研究

目的:利用高通量测序和生物信息学技术,从基因组水平上评价、比较微生态活菌制品乳酶生(乳酶生株)和表飞鸣(表飞鸣株)生产用菌株的安全性和有效性,为微生态活菌制品生产用菌株的质量研究、一致性评价等提供依据。方法:以DIAMOND技术为核心,结合个性化数据库构建检索技术,通过序列比对寻找目标基因并分析其功能。结果:乳酶生和表飞鸣生产用菌株均为屎肠球菌,两株菌的基因组间共线性关系较好,存在少量的插入、缺失、倒位和易位等基因重排事件。表飞鸣株在毒力基因、耐药性基因、细菌素基因、生物胺基因、原噬菌体以及移动遗传元件等6个方面的安全性与乳酶生株相似,但是在包括应激反应基因、抗菌/拮抗活性基因、抗氧化活性基因以及附着力基因等益生性功能等方面,表飞鸣株优于乳酶生株。结论:本文初步建立了基于特定基因功能分析的微生态活菌制品生产用菌株质量评价方法,进一步完善了微生态活菌制品的质量研究和质量评价体系。

采用16S rDNA全长序列分析和生化反应鉴定乳酶生菌株

目的:对乳酶生菌株进行鉴定,对质量标准修订提供依据。方法:采用16S rDNA全长序列测定,对从不同来源的乳酶生制剂中分离的菌株,生产菌株140623和其他参考菌株进行鉴定,并进行系统发生树分析,同时采用生化反应对鉴定结果进行验证。结果:从乳酶生制剂中分离获得的菌株和生产菌株140623均鉴定为屎肠球菌(Enterococcus faecium),且相互之间具有很高的同源性。结论:现行乳酶生质量标准中的"肠链球菌(Streptococcus faecalis)"建议改名为"屎肠球菌(Enterococcus faecium)"。

乳酶生生产菌株的鉴定及耐药谱的分析

目的对乳酶生生产用菌株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)140623株进行全面系统鉴定,检测该菌株耐药谱,为临床用药安全性提供参考。方法利用传统生化、API生化鉴定系统及16S rRNA序列测定对乳酶生生产用菌株粪肠球菌140623株及标准菌株粪肠球菌32222株进行鉴定,利用琼脂扩散纸片法检测其对临床常用10类21种抗生素的敏感性,并免疫小鼠进行菌株毒性试验。结果粪肠球菌140623株为屎肠球菌(Enterococcus faecium);耐药谱显示该菌株对四环素类、氯霉素敏感,对醣肽类中度敏感,对青霉素类、头孢菌素类、喹诺酮类、氨基糖甙类、大环内脂类、单环β-内酰胺类、碳青霉烯类抗生素及磺胺耐药;全部小鼠健康存活,符合"微生态活菌制品"菌种毒性试验要求。结论标准物质目录中标示为"供乳酶生生产用菌株粪肠球菌140623"应为屎肠球菌140623株。对其耐药谱的研究可为临床联合用药及对该菌株的质量控制提供参考。

MALDI-TOF-MS法快速鉴定乳酶生菌株

通过优化蛋白提取溶剂、基质溶剂、点样方式等试验条件,建立了基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术的细菌快速检测方法。以70%甲酸∶乙腈(50∶50)为蛋白提取溶剂,以50%乙腈-2.0%三氟乙酸为基质溶剂,先点细菌蛋白样品再点基质,检测了不同来源乳酶生制剂中分离的菌株、乳酶生生产菌株140623以及其他参考菌株,并对谱图进行聚类分析。结果显示,从乳酶生制剂中分离的菌株与乳酶生生产菌株140623最为接近,为屎肠球菌(Enterococcus faecium)。

乳酶生菌种的鉴定方法研究

目的分析鉴定乳酶生菌种并建立鉴定方法。方法采用生化反应、Vitek 2全自动微生物分析系统及RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定系统方法对市售乳酶生菌种进行鉴定并进行方法学验证。结果 3种方法对乳酶生菌种的鉴定结果均为屎肠球菌Enterococcus faecium;微生物基因指纹鉴定结果显示:市售样品分离菌株与供乳酶生生产菌株肠球菌140623具有很高的同源性;选择山梨醇、阿拉伯糖、甘露醇和棉子糖生化反应作为该菌种的补充鉴定方法。结论所建乳酶生菌种的鉴定方法可行、有效。

乳酶生片微生物限度检查方法研究及卫生状况评价

采用常规法对乳酶生片进行细菌、霉菌和酵母菌计数和控制菌检查,并检验了8个厂家共492批样品。乳酶生片对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用,改用pH 7.0磷酸盐缓冲液营养琼脂培养基可以消除其抑制作用,并作为细菌计数培养基。结果492批样品的合格率为100%。

乳酶生菌种脂肪酸组分的GC-MS检测分析

目的:建立气相色谱-质谱联用法测定乳酶生菌种的脂肪酸成分,并对各试样菌株间的同源性进行分析。方法:应用14%三氟化硼-甲醇法对菌株进行脂肪酸甲酯化,采用HP-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.250 mm×0.25μm),载气为氦气,程序升温(120℃,5 min;6℃·min^(-1)升至240℃,10 min;10℃·min^(-1)至260℃,2 min),进样口温度250℃,选择EI离子源,溶剂延迟3 min,质谱扫描m/z 35~450。结果:肠球菌属的菌株均具有十四碳烷酸、十六碳烷酸、十六碳烯酸、十八碳烷酸、十八碳烯酸及十九碳烷酸特征峰;批号为20100922和20101001的乳酶生片菌株与海氏肠球菌CGMCC1.595之间,6家生产企业的其他乳酶生片菌株与粪肠球菌140623和屎肠球菌CGMCC1.131之间,具有相似的气相色谱图及相近的脂肪酸组分比值。结论:本方法可用于乳酶生菌种的快速鉴定及同源性分析。

乳酶生菌种的安全性研究

目的对乳酶生菌种进行安全性研究。方法采用VITEK2 Compact全自动微生物分析系统检测菌种药物敏感性,提取质粒进行电泳,并对小鼠灌胃进行毒性试验。结果粪肠球菌140623对克林霉素和大环内酯类抗菌药物具有天然耐药性,对青霉素类、高浓度氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、糖肽类、链阳霉素类、唑烷酮类及呋喃妥因均敏感,含有质粒;粪肠球菌CGMCC1.595对上述抗菌药物均敏感,不含质粒。毒性试验结果符合中国药典2010版的要求。结论乳酶生菌种具有一定的安全性,但需加强生产菌株的管理并规范其来源。

乳酶生片及其原料质量标准酸度测定试验研究

目的选用3种市售纯牛奶和2种脱脂奶粉(采用多种奶源材质制备不同的牛奶培养基),按照优选乳酶生质量标准鉴别中酸度测定试验培养基,为乳酶生质量标准提高提供参考。方法分别将蒙牛、伊利、银桥3种纯牛奶,完达山和银桥2种脱脂奶粉制备牛奶培养基,比较采用不同牛奶培养基进行酸度测定试验结果。结果蒙牛、伊利和银桥纯奶制备的牛奶培养基分别对不同厂家和批次的乳酶生检测合格率分别为61.54%(16/26)、65.38%(17/26)和57.69%(15/26);采用完达山和伊利脱脂奶粉制备的牛奶培养基对乳酶生检测合格率分别为100%(26/26)和96.15%(25/26)。结论完达山脱脂奶粉制备的牛奶培养基酸度测定值最高,合格率最好;其次为伊利脱脂奶粉,3种纯奶酸度测定值较低,合格率较差,采用不同的奶源材质制备的不同培养基直接影响乳酶生酸度的测定。