Lactoferricin B基因与几种变异克隆的构建及其在酿酒酵母中的表达与鉴定

目的构建牛乳铁多肽(Lactoferricin B)的真核表达质粒pYES2/Lactoferricin B,实现其在酿酒酵母S.cerevisiae中的表达,并初步检测其不同变异的体外抗菌活性。方法通过分别合成Lactoferricin B基因两条单链的部分序列,让其互为模板、引物进行PCR扩增,得到Lactoferricin B与3种变异的基因序列。将它们克隆到穿梭质粒pYES2中,构建pYES2/Lactoferricin B及3种变异基因重组质粒,转化到大肠杆菌Top10中,让其大量增殖。提取重组质粒经纯化后将其转化到S.cerevisiae中,通过营养缺陷型筛选获得重组酵母菌并通过半乳糖诱导使其表达目的蛋白。经离子交换柱纯化收集目的蛋白后,通过体外抑菌实验比较Lactoferricin B及3种变异重组蛋白的抗菌活性。结果经PCR扩增检验、DNA测序表明成功构建pYES2/Lactoferricin B与3种变异基因重组质粒。提取诱导后的蛋白进行SDS-PAGE电泳及质谱检测,证实目的蛋白的存在,相对分子质量约为3.4×103。在大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌的抑菌实验中观测到Lactoferricin B和A17-Lactoferricin B产生了抑菌圈。结论成功构建pYES2/Lactoferricin B及变异基因重组质粒,该重组质粒能在S.cerevisiae中诱导表达目的蛋白,为进一步研究其生物功能及抗菌活性奠定了基础。

抗菌肽Lactoferricin B的原核表达及其纯化

牛乳铁蛋白活性多肽(Lactoferricin B,LfcinB)是一种阳离子型抗菌肽,因其具有多种生物学功能,现已被认为具有能够替代传统抗生素的发展前景。然而,由于传统的分离制备方法存在诸多弊端,所以基于基因工程的原核表达技术在制备高纯度和高效表达的该蛋白方面具有极其深远的意义。研究旨在摸索出一套完整的利用原核表达技术制备LfcinB的分子生物学方法。依据大肠杆菌密码子偏爱性的原则,设计了LfcinB的基因序列,通过人工合成的方法获得该基因的优化序列,借助Bam HI和Sal I双酶切、连接等手段将其构建到原核表达载体pGEX-4T-2上,获得重组表达载体pGEX-4T-2-LCB,将该载体转化E.coli Rosetta(DE3)。使用IPTG诱导,结果发现LfcinB在大肠杆菌中表达量超过20%。通过一系列蛋白纯化技术分离得到纯度达到95%以上的LfcinB融合蛋白。抑菌试验结果表明,重组抗菌肽LfcinB融合蛋白具有很好的抑菌活性。研究结果为人们使用基因工程技术制备抗菌肽LfcinB提供了具有重要参考价值的技术路线和理论依据。

乳铁素B的抗菌活性及其影响因素

乳铁素B是牛乳铁蛋白经胃蛋白酶酶解后得到的最重要的抗菌肽,具有较强抗菌活性. 研究表明,乳铁素B对大肠杆菌的最小抑菌质量浓度为0.5 mg/mL,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.4 mg/mL;葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、牛血清白蛋白(BSA)、尿素、硫酸铵在0～10 mg/mL,乳糖、可溶性淀粉在0～4 mg/mL的质量浓度范围内,对乳铁素B的抗菌活性影响不大;当NaCl或KCl的浓度为25～100 mmol/L,MgCl2或CaCl2的浓度为1.0～5.0 mmol/L时,乳铁素B的抗菌活性就会大大降低;随着缓冲盐浓度和有机酸浓度(25～100 mmol/L)的增大,乳铁素B的抗菌活性呈下降趋势,且在微碱性环境下乳铁素B表现出较强的抗菌活力.

牛乳铁蛋白肽基因LfcinB的合成及真核表达载体的构建

根据APD抗菌肽数据库报道的牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列,合成编码LfcinB基因的2条互补的寡核苷酸链,退火后在5′端和3′端分别形成含有BamHI和XhoI位点粘性末端的双链DNA。真核表达载体pcDNA3.1(+)经BamHI和XhoI限制性内切酶双酶切处理后与合成的LfcinB基因进行连接,连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞,提取质粒DNA进行测序。测序结果显示,牛乳铁蛋白肽LfcinB基因成功克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,为进一步表达和抗菌活性研究奠定物质基础。

抗菌肽与抗生素对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的体外协同抗菌效果研究

本试验旨在研究抗菌肽与抗生素联合使用对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌的作用效果。通过最小抑菌浓度(mini muminhibitory concentration,MIC)测定,联合药敏试验,研究牛乳铁蛋白肽(Lactoferricin B,LFcin B)、天蚕素A(Cecropin A)及金霉素、新霉素对大肠杆菌(Escherichia coliATCC25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylo-coccus aureus ATCC25923)、猪霍乱沙门氏菌(Sal monella choleraesuis CMCC50013)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa CMCC10014)的体外协同抗菌效应。结果表明:Cecropin A与LFcin B联合使用对所试革兰氏阴性菌均表现为协同作用,两者联用时的MIC分别是单用时的1/4和1/8～1/4;金霉素与LFcin B联合使用对革兰氏阴性菌和阳性菌表现为协同作用,两者联用时的MIC是单用时的1/8～1/4;另外,Cecropin A与金霉素联合使用对革兰氏阴性菌也表现为协同作用。4种药物的两两合用对受试菌株均不表现拮抗作用。结果提示,LFcin B、Cecropin A及金霉素联合使用对革兰氏阴性菌及阳性菌具有协同作用。

重组牛乳铁蛋白素在大肠杆菌中的表达

将牛乳铁蛋白素(lactoferricin B)基因克隆到表达载体pET28a后,转化到BL21大肠杆菌表达系统,筛选表达温度和诱导剂IPTG的浓度,使其在原核表达系统中表达,将诱导表达的产物进行Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳及抑菌活性检测,证明该表达产物是乳铁蛋白素。实验结果表明,LactoferricinB基因能够在原核表达系统中表达,表达量约占细菌总蛋白的21%,而且表达的蛋白质具有生物学活性。

改进Tricine-SDS-PAGE法分析重组牛乳铁蛋白肽

为了有效分离3.1kDa乳铁蛋白肽,试验调整分离胶中聚丙烯酰胺浓度及凝胶的交联度,并加入适量甘油,改进了传统的Tricine-SDS-PAGE方法。结果表明,该方法与常规的SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE相比较,改进的凝胶不仅可以有效分离3.1kDa的肽,而且对分子量为212kDa的大分子量蛋白也有很好的分离效果,明显优于常规的SDS-PAGE和现有的Tricine-SDS-PAGE方法。

牛乳素真核表达载体的构建

以牛乳素为目的基因,构建含有组氨酸标签、人生长激素信号肽的真核表达载体,为利用牛乳素在活体动物及培养细胞中的表达提供基因材料。用人工合成hGH-Lacf B的序列与T载体连接,用Xho I和BamH I酶切后与相应酶切处理的pVAX1连接,取阳性克隆质粒,用EcoR I和Xho I酶切回收含hGH的pVAX1载体,再与经过PCR扩增的his-Lacf B连接,酶切鉴定及测序。DNA序列分析表明,携带hGH、6×his和目的基因Lacf B已成功连接到真核表达载体pVAX1中。

合成甜味剂对牛乳铁素抗菌活性的影响

乳铁素B是牛乳铁蛋白经胃蛋白酶酶解后得到的最重要的抗菌肽,具有很强的抗菌活性。选取大肠杆菌为实验菌株,进行了合成甜味剂对乳铁素抑菌活性影响的研究。研究表明,在牛肉膏蛋白胨培养基中,pH7.0,菌浓为107CFU/ml的条件下,纯化乳铁素B对大肠杆菌的最小抑菌质量浓度为20μg/ml;阿斯巴甜、甜蜜素、糖精钠在0～5mg/ml的质量浓度范围内,对乳铁素B的抗菌活性都有削弱的作用;而安塞蜜在0～5mg/ml的质量浓度范围内,对乳铁素B的抗菌活性没有太大的影响。