LAMR1与PER1蛋白作用位点的筛选

目的:筛选出与PER1蛋白相互作用的LAMR1的核心位点。方法:采用盒式定点突变法,对重组目的质粒pGADT7-Rec/Lamr1201-295的插入片段Lamr1201-295羧基末端的205-216氨基酸序列RDPEEIEKEEQA进行定点突变,并以hPER1蛋白的bHLH-PAS结构域为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统确定这4种不同的突变LAMR1201-295片段与hPER1的相互作用。结果:营养缺陷培养基筛选显示4种转化菌在二缺SD/-Leu/-Trp、三缺SD/-His/-Leu/-Trp和四缺SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp固体培养基上都可以生长;β-半乳糖苷酶印膜法检测结果显示4种转化菌均可显色。结论:突变片段LAMR1-RDP,LAMR1-EEI,LAMR1-EKE和LAMR1-EQA都能够与hPER1的bHLH-PAS结构域在酵母中发生相互作用。提示LAMR1的205-216Aa可能不是其与hPER1相互作用的核心氨基酸序列。

稳定表达LamR的RK13细胞系的建立及RHDV吸附能力的初步研究

为建立稳定表达层黏连蛋白受体（LamR）RK13细胞系（RK13-LamR）,并研究LamR蛋白在兔出血症病毒（RHDV）与宿主细胞结合中的作用,将完整的LamR序列通过同源重组克隆入慢病毒表达载体pLVX-m Cherry,并将该重组质粒pLVX-m Cherry-LamR与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG共转染293T细胞,在293T细胞中包装成含目的基因的重组慢病毒。将收获的重组病毒感染RK13细胞,经过嘌呤霉素筛选和细胞有限稀释法,筛选出表达LamR蛋白的RK13细胞。通过间接免疫荧光试验（IFA）和Western blotting证明所获细胞株能够稳定表达LamR蛋白,将细胞株命名为RK13-LamR。以纯化的RHDV接种RK13-LamR细胞,IFA检测结果显示,LamR蛋白能促进RHDV对RK13细胞的吸附。本研究建立了RHDV相对敏感的细胞株,证实在RHDV吸附宿主细胞的过程中,LamR蛋白起到一定的作用。

兔肝细胞中与RHDV VP60 P2亚区相互作用蛋白质的筛选和初步鉴定

兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60P2亚区在病毒感染宿主细胞过程中可能起重要作用,为找寻RHDV靶细胞——兔肝细胞中与P2亚区相互作用的蛋白质,以原核表达的P2蛋白为诱饵蛋白质,通过免疫共沉淀试验(Co-IP)结合质谱分析筛选与之有相互作用的肝细胞蛋白质。经分析选取层黏连蛋白受体(LamR)蛋白做进一步研究。提取兔肝细胞总RNA,反转录扩增LamR基因,将其插入pGEX-6p-1载体,经IPTG诱导表达,获得GST-LamR融合蛋白,并通过GST pull-down试验验证LamR蛋白与P2蛋白的结合。结果显示,以P2蛋白为诱饵蛋白质,免疫共沉淀试验结合质谱分析共筛选到26个与P2存在相互作用的肝细胞蛋白质,其中LamR蛋白是多种病毒的受体。通过原核表达系统表达了LamR蛋白,经pull-down试验验证了LamR蛋白与P2蛋白有直接的相互作用。本研究证实兔肝细胞LamR蛋白与RHDV VP60P2蛋白的相互作用,为深入研究RHDV的感染过程、揭示RHDV的致病机制提供了线索。

层黏连蛋白受体1单克隆抗体抑制博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化

目的研究层黏连蛋白受体1(LAMR1)单克隆抗体(mAb)干预博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化。方法雄性SD大鼠72只,随机分为LAMR1 mAb组(L)、对照组(C)和模型组(M)3组,气管内滴入博莱霉素(5 mg/kg体质量)制备肺纤维化模型。3组分别给予LAMR1 mAb、地塞米松、生理盐水3次/周,腹腔注射,于第7、14、28天处死8只大鼠。HE染色观察肺纤维化程度;免疫组化方法检测肺组织中表面活性物质A(SP-A)的含量;ELISA测定血清中羟脯氨酸(Hyp)的含量;PCR方法检测肺组织中基质金属蛋白酶9(MMP-9)及转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA的含量。结果各时间段,M组肺纤维化程度及Hyp含量均高于C组和L组,SP-A的含量均低于其余两组,M组肺组织的MMP-9和TGF-β1的mRNA的含量明显高于其余两组。结论 LAMR1 mAb可明显减轻博莱霉素诱导的肺纤维化程度。

门诊患者倍他乐克不规范用药分析

目的:针对门诊患者使用倍他乐克不规范的原因进行分析,为临床规范用药提供参考。方法:搜集2011年7月本院心内科普通门诊服用倍他乐克的患者病例,分析其中用药不当的原因以及各种具体表现。结果:373例使用倍他乐克的患者中,不规范用药者占9.39%,包括了用量、用法不正确、擅自减量、停药以及拒绝用药等12种用药不当的具体表现。在不规范用药的患者中,有9人随访间隔时间明显短于其余患者(P<0.05),但未被告知调整药物剂量。有8位患者年龄显著高于其余患者(P<0.05),由于独居或行动不便,随访间隔时间明显长于其余患者(P<0.05)。结论:倍他乐克使用不规范的情况并不少见,应当加强临床医师的教育以及对患者的宣教,增加用药的依从性,提高倍他乐克用药的规范性与合理性。