层粘连蛋白α4链功能肽修饰脱钙骨基质支架诱导H型血管及骨生成促进骨缺损修复的实验研究

目的基于选择性细胞滞留(selective cell retention,SCR)技术中的细胞与细胞外基质黏附理论,拟设计一种简化多肽表面修饰脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM),以期能同时促进骨再生与血管生成。方法选择层粘连蛋白(laminin,LN)α4链核心区域功能肽(LNα4)、环状RGD(cyclic RGDfK,cRGD)和带胶原结构域肽(collagen-binding domain,CBD),固相合成CBD-LNα4-cRGD多肽,表面修饰于DBM,构建DBM/CBD-LNα4-cRGD(以下简称DBM/LN)支架材料。观测DBM/LN形态特征、CBD-LNα4-cRGD表面修饰DBM的稳定性以及CBD-LNα4-cRGD表面修饰对小鼠血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)黏附、增殖以及管腔形成的影响,Western blot验证其影响EPCs血管生成的分子机制。然后,取24只10周龄雄性C57小鼠制备2 mm长股骨缺损模型,分别采用经SCR技术处理的DBM/LN(DBM/LN组,n=12)和DBM(DBM组,n=12)修复骨缺损。术后8周,行影像学检查、血管造影、组织学及免疫荧光染色[CD31、内皮黏蛋白(endomucin,Emcn)、Ki67]观察,评估DBM/LN促进血管生成和骨再生能力。结果材料相关检测显示,与DBM相比,DBM/LN表面更粗糙,但孔径差异无统计学意义(t=0.218,P=0.835);经SCR技术处理后,荧光强度提示DBM/LN支架稳定有效;与DBM相比,CBD-LNα4-cRGD表面修饰后,DBM/LN能黏附更多的EPCs(P<0.05),且增殖速度增加、管腔形成能力增强。Western blot检测示DBM/LN中EPCs表达VEGF、p-FAK和pERK1/2水平显著高于DBM(P<0.05)。动物实验观测显示,与DBM组相比,DBM/LN组骨缺损处血管生成和骨再生能力更强,血管体积和血管表面积差异均有统计学意义(P<0.05),CD31hi Emcnhi细胞数量显著增加(P<0.05)。结论DBM/LN支架材料能促进EPCs黏附、H型血管生成,实现小鼠骨缺损修复中血管生成和骨再生的有效耦联。

钠钾泵Scr复合体对幼年哮喘大鼠气道炎症和气道重塑的影响及其机制研究

背景研究表明,Na+-K+-ATP酶活性药物具有抑制哮喘的作用,但具体机制尚不清楚。目的探究钠钾泵Scr复合体对幼年哮喘大鼠气道炎症和气道重塑的影响及其机制。方法本实验时间为2019年7月—2020年8月。将120只8周龄SD雄性大鼠分为对照组(腹腔注射5%磷酸盐缓冲液)、哮喘组〔腹膜注射乳化的卵清蛋白(OVA,Ⅴ级)致敏,造模成功后腹膜注射二甲亚砜〕及治疗组(腹膜注射乳化的OVA致敏,造模成功后腹膜注射钠钾泵Scr复合体药物),每组40只。采用实用荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测肺组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶相对表达量,采用蛋白质免疫印迹法检测肺组织Scr、层粘连蛋白α4(LAMα4)相对表达量,通过苏木素-伊红(HE)染色检测气道炎性细胞浸润情况,通过高碘酸-席夫(PAS)染色检测杯状细胞,采用免疫组织化学法(IHC)检测转化生长因子β1(TGF-β1)和血管内皮生长因子(VEGF)表达量,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肺组织白介素13(IL-13)和内皮素1(ET-1)含量。结果哮喘组和治疗组大鼠肺组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr相对表达量低于对照组,LAMα4相对表达量高于对照组(P<0.05);治疗组大鼠肺组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr相对表达量高于哮喘组,肺组织LAMα4相对表达量低于哮喘组(P<0.05)。哮喘组和治疗组大鼠肺组织炎症评分高于对照组,PAS阳性面积占比大于对照组(P<0.05);治疗组大鼠肺组织炎症评分低于哮喘组,PAS阳性面积占比小于哮喘组(P<0.05)。哮喘组和治疗组大鼠肺组织TGF-β1和VEGF表达高于对照组,治疗组大鼠肺组织TGF-β1和VEGF表达低于哮喘组(P<0.05)。哮喘组和治疗组大鼠肺组织IL-13和ET-1高于对照组,治疗组大鼠肺组织IL-13和ET-1低于哮喘组(P<0.05)。结论钠钾泵Scr复合体可抑制幼年哮喘大鼠气道炎症及气道重塑,其机制可能与调控LAMα4表达及抑制TGF-β1、VEGF、IL-13和ET-1的释放有关。