牛LATS2基因启动子克隆及转录调控分析

本研究旨在探究牛LATS2基因组织表达规律,利用相对荧光素酶活性数值确定其启动子核心区域并初步鉴定其核心区域关键转录因子,以阐明牛LATS2基因的转录调控机制。利用RT-qPCR检测牛LATS2基因在心、脾、肝、肾、肺、背最长肌、皮下脂肪、皱胃、大肠及睾丸等中的相对表达量,构建LATS2蛋白进化树。克隆LATS2基因5′端非翻译区上游1.7 kb序列,利用逐段缺失引物,巢式扩增其7个启动子区不同截断体缺失片段(-1792~+179、-1475~+179、-1098~+179、-727~+179、-515~+179、-248~+179和-56~+179),并将不同截断体构建至双荧光素酶报告载体pGL3-Basic上。重组的LATS2基因启动子双荧光素载体分别转染小鼠成肌细胞(C2C12)和小鼠脂肪细胞(3T3-L1)细胞系,鉴定其启动子核心区域。进一步借助在线软件JASPAR(http://jaspar.genereg.net/)和Genomatix(http://www.genomatix.de/cgi-bin//mat-inspector)分析启动子核心区域序列特征,并预测关键转录因子结合位点。结果显示,LATS2基因在肝和背最长肌中表达量极显著高于脾(P<0.01);LATS2蛋白构建的进化树显示反刍动物单独聚为1支,表明LATS2基因在反刍动物进化过程中保守性较高;蛋白质互作分析筛选出的与LATS2蛋白互作紧密的前10种蛋白质均为Hippo信号通路中的关键蛋白质。LATS2基因启动子核心区域位于-248~-56,预测其启动子核心区域有与肌肉发育相关的转录因子TEAD1、MEF2A、FOSL1、MyoG和Myod1的结合位点,表明LATS2基因在牛肌肉生长发育中扮演重要角色。以上结果为探究牛LATS2基因在肌肉生长发育中转录调控机制奠定基础。

Hippo信号通道中Lats2基因表达与湖羊肌肉生长发育的关系

[目的]探究Hippo信号通道中Lats2基因与湖羊肌肉生长发育的关联性。[方法]以湖羊作为试验材料,用RT-qPCR技术分析Lats2基因在不同性别、不同生长阶段(2、60、180日龄)、不同肌肉组织(比目鱼肌、背最长肌、腓肠肌和趾长伸肌)的时空表达规律,及其与Lats1、YAP1(Yes相关蛋白1)基因和肌肉生长相关基因在不同生长阶段的相关性。[结果]根据Hippo信号通道中Lats2基因的时空表达规律可以发现:在不同肌肉组织中,Lats2基因在趾长伸肌中相对表达量最高;在不同生长阶段,Lats2基因在60日龄的表达量最高;在不同性别中,Lats2基因的表达表现为公羊高于母羊。相关性分析结果表明:在2日龄肌肉组织中,Lats2基因的表达与MSTN基因间正相关(P<0.05);在60日龄的肌肉组织中,Lats2基因的表达与Lats1基因正相关(P<0.05);在180日龄肌肉组织中,Lats2基因的表达与MyoG基因间极显著正相关(P<0.01),与YAP1基因间显著负相关(P<0.05)。[结论]Hippo信号通道中Lats2基因的表达受不同性别、年龄和肌肉组织的影响,可能通过下调YAP1基因的表达抑制肌肉生长发育,可作为肌肉生长发育调控研究的候选基因。

miR-15b-5p通过靶向LATS2基因调控前列腺癌细胞侵袭、迁移以及凋亡的分子机制

目的探讨miR-15b-5p靶向大肿瘤抑制分子(LATS2)基因对前列腺癌PC-3细胞侵袭、迁移及凋亡的影响及机制。方法将anti-miR-15b-5p及anti-miR-15b-5p+si-LATS2(同时抑制miR-15b-5p和LATS2表达)转染前列腺癌PC-3细胞,48 h后,通过qRT-PCR检测miR-15b-5p mRNA表达,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。双荧光素酶报告系统检测miR-15b-5p与LATS2的靶向关系。Western blotting检测LATS2、β-catenin、MMP-2和Bax蛋白表达。结果 PC-3细胞转染anti-miR-15b-5p后,miR-15b-5p mRNA表达明显降低,细胞侵袭和迁移能力明显降低,细胞凋亡率明显升高(P <0. 05)。miR-15b-5p与LATS2存在靶向关系,抑制LATS2表达后可明显减弱anti-miR-15b-5p对PC-3细胞侵袭、迁移、凋亡及β-catenin、MMP-2和Bax蛋白表达的影响(P <0. 05)。结论抑制miR-15b-5p可明显降低前列腺癌PC-3细胞的侵袭和迁移能力,并诱导细胞凋亡,其机制与靶向LATS2抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

双荧光素酶报告基因技术验证miR-31对LATS2的靶向调控作用

目的通过双荧光素酶报告基因技术验证miR-31对大肿瘤抑制因子2(LATS2)的靶向调控作用,观察miR-31在心肌细胞肥大过程中的可能影响。方法运用Targetscan软件预测大鼠miR-31对LATS2的靶向调控作用;以双荧光素酶报告质粒为工具载体,分别插入人工合成的大鼠LATS2基因野生型3′UTR(LATS2-3′UTR-WT)及突变型3′UTR(LATS2-3′UTR-MU)片段,构建LATS2-3′UTR-WT及LATS2-3′UTR-MU双荧光素酶报告质粒;重组双荧光素酶报告质粒分别与miR-31过表达质粒共转染293T细胞,检测荧光素酶活性并分析miR-31对LATS2的靶向调控作用;血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导体外心肌细胞肥大模型,RT-qPCR检测miR-31、LATS2及心肌细胞肥大基因心房钠尿肽(ANP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)的表达,F肌动蛋白荧光探针观察心肌细胞形态变化。结果Targetscan软件预测结果显示,大鼠miR-31与LATS2基因3′UTR存在互补结合位点;经酶切及基因测序鉴定,成功构建LATS2-3′UTR-WT及LATS2-3′UTR-MU双荧光素酶报告质粒;与LATS2-3′UTR-MU+miR-31组相比,LATS2-3′UTR-NC+miRNA-31组荧光素酶活性无明显变化(0.98±0.03vs.1.00±0.03,P>0.05),而LATS2-3′UTR-MT+miR-31组与LATS2-3′UTR-NC+miR-31组相比,荧光素酶活性显著降低(0.74±0.02vs.1.00±0.03,P<0.01);AngⅡ诱导48h后可检测到心肌细胞肥大基因ANP(P<0.01)及β-MHC表达上调(P<0.05),心肌细胞肥大过程中miR-31表达显著上调(P<0.01),LATS2基因明显下调(P<0.05),96h后心肌细胞表面积明显增大。结论miR-31可通过与LATS2基因3′UTR互补结合实现其对LATS2靶向调控作用,miR-31靶向作用LATS2可能参与调控心肌细胞的肥大。