牛LATS2基因启动子克隆及转录调控分析

本研究旨在探究牛LATS2基因组织表达规律,利用相对荧光素酶活性数值确定其启动子核心区域并初步鉴定其核心区域关键转录因子,以阐明牛LATS2基因的转录调控机制。利用RT-qPCR检测牛LATS2基因在心、脾、肝、肾、肺、背最长肌、皮下脂肪、皱胃、大肠及睾丸等中的相对表达量,构建LATS2蛋白进化树。克隆LATS2基因5′端非翻译区上游1.7 kb序列,利用逐段缺失引物,巢式扩增其7个启动子区不同截断体缺失片段(-1792~+179、-1475~+179、-1098~+179、-727~+179、-515~+179、-248~+179和-56~+179),并将不同截断体构建至双荧光素酶报告载体pGL3-Basic上。重组的LATS2基因启动子双荧光素载体分别转染小鼠成肌细胞(C2C12)和小鼠脂肪细胞(3T3-L1)细胞系,鉴定其启动子核心区域。进一步借助在线软件JASPAR(http://jaspar.genereg.net/)和Genomatix(http://www.genomatix.de/cgi-bin//mat-inspector)分析启动子核心区域序列特征,并预测关键转录因子结合位点。结果显示,LATS2基因在肝和背最长肌中表达量极显著高于脾(P<0.01);LATS2蛋白构建的进化树显示反刍动物单独聚为1支,表明LATS2基因在反刍动物进化过程中保守性较高;蛋白质互作分析筛选出的与LATS2蛋白互作紧密的前10种蛋白质均为Hippo信号通路中的关键蛋白质。LATS2基因启动子核心区域位于-248~-56,预测其启动子核心区域有与肌肉发育相关的转录因子TEAD1、MEF2A、FOSL1、MyoG和Myod1的结合位点,表明LATS2基因在牛肌肉生长发育中扮演重要角色。以上结果为探究牛LATS2基因在肌肉生长发育中转录调控机制奠定基础。

Hippo信号通道中Lats2基因表达与湖羊肌肉生长发育的关系

[目的]探究Hippo信号通道中Lats2基因与湖羊肌肉生长发育的关联性。[方法]以湖羊作为试验材料,用RT-qPCR技术分析Lats2基因在不同性别、不同生长阶段(2、60、180日龄)、不同肌肉组织(比目鱼肌、背最长肌、腓肠肌和趾长伸肌)的时空表达规律,及其与Lats1、YAP1(Yes相关蛋白1)基因和肌肉生长相关基因在不同生长阶段的相关性。[结果]根据Hippo信号通道中Lats2基因的时空表达规律可以发现:在不同肌肉组织中,Lats2基因在趾长伸肌中相对表达量最高;在不同生长阶段,Lats2基因在60日龄的表达量最高;在不同性别中,Lats2基因的表达表现为公羊高于母羊。相关性分析结果表明:在2日龄肌肉组织中,Lats2基因的表达与MSTN基因间正相关(P<0.05);在60日龄的肌肉组织中,Lats2基因的表达与Lats1基因正相关(P<0.05);在180日龄肌肉组织中,Lats2基因的表达与MyoG基因间极显著正相关(P<0.01),与YAP1基因间显著负相关(P<0.05)。[结论]Hippo信号通道中Lats2基因的表达受不同性别、年龄和肌肉组织的影响,可能通过下调YAP1基因的表达抑制肌肉生长发育,可作为肌肉生长发育调控研究的候选基因。

miR-15b-5p通过靶向LATS2基因调控前列腺癌细胞侵袭、迁移以及凋亡的分子机制

目的探讨miR-15b-5p靶向大肿瘤抑制分子(LATS2)基因对前列腺癌PC-3细胞侵袭、迁移及凋亡的影响及机制。方法将anti-miR-15b-5p及anti-miR-15b-5p+si-LATS2(同时抑制miR-15b-5p和LATS2表达)转染前列腺癌PC-3细胞,48 h后,通过qRT-PCR检测miR-15b-5p mRNA表达,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。双荧光素酶报告系统检测miR-15b-5p与LATS2的靶向关系。Western blotting检测LATS2、β-catenin、MMP-2和Bax蛋白表达。结果 PC-3细胞转染anti-miR-15b-5p后,miR-15b-5p mRNA表达明显降低,细胞侵袭和迁移能力明显降低,细胞凋亡率明显升高(P <0. 05)。miR-15b-5p与LATS2存在靶向关系,抑制LATS2表达后可明显减弱anti-miR-15b-5p对PC-3细胞侵袭、迁移、凋亡及β-catenin、MMP-2和Bax蛋白表达的影响(P <0. 05)。结论抑制miR-15b-5p可明显降低前列腺癌PC-3细胞的侵袭和迁移能力,并诱导细胞凋亡,其机制与靶向LATS2抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

LATS2基因通过Wnt信号通路对H9C2心肌细胞保护的作用机制研究

目的探讨大肿瘤抑制因子2(LATS2)基因对缺氧复氧(H/R)诱导的H9C2心肌细胞凋亡及Wnt信号通路的影响。方法 LATS2 siRNA或LATS2过表达质粒转染H9C2心肌细胞,并分别转染阴性对照siRNA及空载体(vector),转染48 h后,通过Western blotting检测转染后的各组细胞中LATS2的蛋白表达;建立H/R模型,细胞分为正常对照组(Control组)、单纯缺氧复氧组(H/R组)、H/R+LATS2-siRNA组和H/R+pcDNA3.1-LATS2组,流式细胞术检测各组细胞凋亡率及活性氧(ROS)含量;Western blotting检测凋亡蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)及Wnt信号通路β-连环蛋白(β-catenin)和c-myc的蛋白表达。结果 siRNA组和PcDNA3.1组的LATS2蛋白表达与Control组差异无统计学意义(P>0.05),而LATS2-siRNA组LATS2的蛋白表达显著低于Control组(P<0.05),pcDNA3.1-LATS2组LATS2的蛋白表达显著高于Control组(P<0.05);与Control组比较,H/R组细胞凋亡率、ROS含量及cleaved caspase3、β-catenin和c-myc的蛋白表达均显著升高(P<0.05),与H/R组比较,H/R+LATS2-siRNA组细胞凋亡率、ROS含量及cleaved caspase3、β-catenin和c-myc的蛋白表达均显著升高,H/R+pcDNA3.1-LATS2组细胞凋亡率、ROS含量及cleaved caspase3、β-catenin和c-myc的蛋白表达均显著降低(P<0.05)。结论抑制LATS2基因表达可诱导心肌细胞凋亡及上调Wnt信号通路,而抑制LATS2基因表达反之。

miR-103通过抑制LATS2促进肝细胞肝癌侵袭转移的机制

目的研究原发性肝癌中miR-103的表达及对肝癌细胞系转移能力的影响。方法 RT-PCR检测miR-103在肝癌组织及肝癌源性细胞系中的表达。分别转染miR-103 mimic至L02细胞、转染miR-103抑制剂至HepG2细胞,CCK8法检测miR-103对细胞增殖的影响,TUNEL法检测miR-103对细胞凋亡的影响,Transwell实验检测miR-103对肿瘤细胞侵袭和转移的影响。生物信息学分析miR-103的靶基因,western blot验证靶基因表达与rmiR-103的相关性。结果 miR-103在肝癌标本和肝癌源性细胞系中表达上调,miR-103可以促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,Transwell实验结果表明miR-103增加细胞侵袭和转移能力。生物信息学分析表明拉特抑癌基因同源分子2(LA,TS2)为miR-103的潜在靶基因。miR-103的表达与LATS2呈负相关。结论以上数据证明miR-103通过抑制LA,TS2促进肝细胞肝癌侵袭转移,miR-103/LA,TS2失调有可能成为治疗肝癌的新靶点。