D-101大孔吸附树脂分离放线菌Streptomyces lavendulae gCLA4活性成分条件的研究

为了优化大孔吸附树脂分离放线菌Streptomyces lavendulae gCLA4发酵液中活性成分的条件,以洗脱液对猕猴桃溃疡菌(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)抑菌活性的强弱为评价指标,采用D-101大孔吸附树脂对放线菌Streptomyces lavendulae gCLA4的发酵液进行吸附和洗脱试验。结果表明:当发酵液上样量为100mL,pH为6,洗脱流速为150mL/h,解析溶剂为φ=80%的丙酮水溶液,洗脱体积为40mL时,洗脱液的抑菌圈直径最大,吸附解析效果最好。说明,D-101大孔吸附树脂可用于分离放线菌Streptomyces lavendulae gCLA4发酵液中的活性成分。

Streptomyces lavendulae X33海藻糖合酶基因克隆及酶学特性

【目的】海藻糖是一种由2个葡萄糖分子以α,α-1,1-糖苷键连接的非还原性双糖,在生物制品的保护剂方面具有良好的应用前景。海藻糖合酶(Trehalose Synthase,EC.5.4.99.16)可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,该反应仅需一步,且所用原料低廉,在酶法生产海藻糖上显示出一定的应用潜力。对链霉菌Streptomyces lavendulae X33中编码海藻糖合成酶的基因SlTs进行克隆,通过原核表达获得重组海藻糖合成酶,并研究其酶学性质。【方法】以Streptomyces lavendulae X33基因组DNA为模板,使用加尾PCR的方法克隆编码海藻糖合成酶的基因,构建含有组氨酸标签的重组表达载体,并将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。重组蛋白经Ni-NTA纯化,以麦芽糖为底物研究其酶学性质,包括最适温度、最适pH和pH稳定性及金属离子和抑制剂的影响。【结果】从菌株Streptomyces lavendulae X33基因组中克隆得到了海藻糖合成酶基因片段SlTs GenBank登录号为MW217513。SlTs全长1719 bp,编码一个572个氨基酸的蛋白SlTs,分子量大小为66 ku。氨基酸序列分析表明SlTs与来源于Thermomonospora curvata DSM 43183的海藻糖合酶最高相似性为84%,与其它已报道的海藻糖合酶有较大差异。序列比对的结果显示SlTs与已解析结构的海藻糖合酶TcTs(PDB.5h2t)等具有的基序“DGGYD”“NHTS”“QPDLN”“RXDAVPYL”“LLAEANQ”“LRNHDELTLE”高度保守,具有一个由Asp218-Glu260-Asp330构成的活性中心,表明SlTs归属于糖苷水解酶GH13家族。经异源表达,Ni^(2+)-NTA亲合层析后进行纯化。重组酶rSlTs最适反应温度为20℃,最适反应pH为7.5,在以麦芽糖为底物,最适反应条件下测得的比活力为67.6 U/mg。重组酶rSITs在20℃下处理1 h活力不变,处理9 h时,残留酶活为60%。但在50℃下处理0.5 h活力丧失,表明rSITs对热敏感。重组酶rSITs在pH5.0-8.0有活性,最适反应pH为6.0,在pH6.0-7.0处理12 h活力稳定。1 mmol/L Ca^(2+)对重组酶rSlTs有激活作用,Ni^(2+)、Zn^(2+)、Cu^(2+)对重组酶rSlTs有抑制作用,其余金属离子对酶活无影响。甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂和SDS对重组酶rSlTs有显著抑制作用,TritonX-100对酶活无显著影响。【结论】首次从Streptomyces lavendulae X33中克隆得到海藻糖合成酶,并对其进行了酶学性质研究,为开发新的海藻糖合成酶提供理论基础。

8-Mop选育薰衣草链霉菌(Streptomyces lavendulae)的研究

本文首次报导8 甲氧基补骨脂素(8 Mop)单一选育薰衣草链霉菌(Streptomyceslavendulae)的研究结果,曾有摇瓶发酵单位提高18.3%的高产株获得,高产株已在国内应用。

西洋参根腐病拮抗菌XT-25的生防作用研究

为探讨西洋参根腐病的生物防治技术,本研究以西洋参根腐病病原茄病镰孢菌(Fusarium solani)和土赤壳属的Ilyonectria mors-panacis为靶标,从西洋参根际土中筛选具有拮抗作用的生防菌,通过对峙培养、菌丝抑制活性、抑菌促生物质测定和离体接种防效等试验,初步探讨拮抗菌株对西洋参根腐病的抑菌机制和防治效果。结果表明,分离到1株对2种西洋参致病菌的抑菌率皆在55%以上的菌株XT-25;结合形态学特征及16S rRNA、atpD和rpoB基因序列系统发育分析结果,将菌株XT-25鉴定为淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae);菌株XT-25对黄瓜枯萎病菌等6种病原菌的抑菌率为59%~70%。菌株XT-25不仅具有分泌蛋白酶、淀粉酶以及β-1,3葡聚糖酶等抑菌物质的能力,还具有溶解有机磷、无机磷、产氨、固氮、以及分泌IAA和ACC脱氨酶等促生物质能力。菌株XT-25挥发性气体对F.solani的抑菌率为9.04%;其可造成F.solani、I.mors-panacis菌丝的畸形。离体接种西洋参的防效试验结果表明,菌株XT-25对致病菌F.solani和I.mors-panacis引致的西洋参根腐病的防治效果分别为40.00%和24.74%。本研究结果为防治由镰孢菌和土赤壳菌引起的西洋参根腐病提供了生防材料和理论参考。

薰衣草挥发油化学成分的GC-MS分析

采用毛细管气质联用法对薰衣草挥发油化学成分进行了研究 ,共确认了其中 2 1种成分 ,占精油总含量的 96.5 5 % .其主要化学成分为芳樟醇 (Linalool) ,乙酸芳樟酯 (Linalyl acetate) ,4-甲基 -1 -(1 -异丙基 ) -3 -环己烯 -1 -醇 (3 -Cyclohexen-1 -o1 ,4-methy1 -1 -1 (1 -methylethyl) -) ,乙酸薰衣草酯 (Lavandayl acetate)等 .

链霉菌ZG0429的分类鉴定与链霉亲和素的分离纯化研究

从土壤中筛选得到1株高产链霉亲和素的放线菌ZG0429,根据形态观察、培养特征、生理生化鉴定以及16S rRNA序列分析,初步判定该菌株为链霉菌属中的淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)。经发酵,ZG0429的链霉亲和素产量可达201.0mg/L。进一步采用硫铵沉淀和凝胶过滤层析纯化,链霉亲和素的回收率为76.87%,纯度可以达到97.03%。该方法简单易行,成本低廉,可得到高产量、高纯度、高活性的目的蛋白,为链霉亲和素发酵产品的大规模纯化提供了依据。

草莓炭疽病拮抗放线菌DTJ-24的筛选及鉴定

本研究采集草莓根际土壤样品15份,用稀释平板法分离获得79株放线菌。以草莓胶孢炭疽菌为指示菌,采用平板对峙法初筛、发酵液生长速率法复筛,获得5株拮抗效果较好的拮抗菌。其中菌株DTJ-24抑菌率达到69.89%,且传代稳定。根据该菌的形态学、生理生化特征及16s r DNA序列系统发育分析结果,确定该菌株为淡紫灰链霉菌。该研究结果是淡紫灰链霉菌对草莓胶孢炭疽菌具有拮抗作用的首次报道。

产1-脱氧野尻霉素微生物菌株的筛选与鉴定

本研究从桑园土壤中经过初筛、复筛鉴定等方法筛选产DNJ的菌株。利用含葡萄糖淀粉酶的琼脂平板,从263个菌株中筛选出7株反应后有不同程度变蓝的菌株。利用反相高效液相色谱法从7株菌株中鉴定出1株产DNJ菌株,菌株命名为SL-429,该菌株在发酵培养基为KCl0.05%、MgSO4·7H2O0.05%、NaNO30.2%、NaCl0.5%、CaCO30.35%、可溶性淀粉4%、大豆粉1%、胰蛋白1%,pH7.2、27℃下发酵,DNJ产量为0.017mg/ml。根据其形态特征、生理生化特征鉴定,初步确定为浅紫灰链霉菌。

微生物源黄酮类化合物的除草活性

菌株SPIR94166是从广西采集的土壤样品中分离得到的具有产除草活性物质菌株,根据其形态学特征、生理生化特性和分子生物学特性等,认为菌株SPIR94166是属于淡紫灰链霉菌。通过对菌种发酵液中除草活性物质的分离,得到3个活性组分,经NMR、红外、质谱等手段分析,这些除草活性物质分别鉴定为染料木素、黄烷酮以及槲皮素。

中生菌素高产菌株的选育

通过中生菌素高产菌株初筛研究,得到在培养基的 pH 值为7.0时,菌落琼脂柱对指示菌抑菌圈的大小与其产素量成正相关;在此基础上,比较了用紫外线处理、低温加紫外线复合处理、原生质体加紫外线复合处理及原生质体融合等4种育种方法,结果所用方法都能有效地提高中生菌素产生菌的效价,其中原生质体加紫外线处理的方法最佳。最终得到了4株高产菌株,产素量比亲株提高了50%～90%,达到5000～6500μg/mL。

中生菌素(农抗751)防治白菜软腐病的效果试验初报

中生菌素是由淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces lavendulae var. hainanensis nov. Var.)产生的一种碱性水溶性N—糖甙类抗生素,对农作物细菌病害及某些真菌病害有广谱抗性。经3年温室、田间小区试验及示范证明,中生菌素防治白菜软腐病效果显著:温室使用浓度60～100ppm,防效为72.8～100％;田间使用浓度100ppm,拌种防效60～65％,拌种加喷施2～3次防效80～100％;但用药时期及雨量会影响药效。

中生菌素对水稻白叶枯病的防治技术研究

实验证明，中生菌素２００倍液对水稻白叶枯病的防治效果达８９％，相当于化学农药１０％叶枯净１５０倍和２５％川化０１８５００倍药液处理。大田最佳施药时机为病株率５～１０％的发病初期，连续防治２～３次可有效控制病情，千粒重提高１７～１８．７％。秧田于３～４叶期和移栽前５天各喷中生菌素１５０倍液一次，可推迟大田发病期４５天，防效高达９０．５７％。同时节省防治成本７０～８０％。

中生菌素产生菌的紫外诱变育种

以中生菌素产生菌C5为出发菌株,经过紫外诱变处理,获得突变株UV-69,其摇瓶发酵效价比出发菌株提高30.2%。传代试验表明,该突变株的高产性能遗传特性较稳定。在15t发酵罐上连续5批验证,平均发酵效价比原生产水平提高47.8%。

农用抗生素B-7的研究 1.产生菌的分类鉴定

从我国海南岛土壤中分离到一株链霉菌B-7,产生多组份的链丝菌素(从1～6),其发酵液对大白菜软腐病有稳定的防治效果,该菌株在形态培养特征和生理生化特性上与淡紫灰链霉菌Streptomyces Lavendulae相似,但又有一定的差别,命名为淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces lavendulae var.hainanensis n.var.)。

飞龙斩血内一株链霉菌属的分离鉴定及抑菌活性检测

采用严格的表面消毒程序以及在培养基中添加抑菌剂的方法从中药植物飞龙斩血中分离得到一株内生放线菌F-3-003,菌株的发酵产物通过纸片扩散法体外检测具有一定的抑菌活性.菌落形态特征和23S rDNA序列分析表明,菌株F-3-003属于链霉菌属,通过16S rDNA序列分析显示菌株F-3-003与多株淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)的序列同源性均高于99%,因此,将菌株F-3-003命名为淡紫灰链霉菌F-3-003,基因登录号为KF751667,本研究为飞龙斩血内生菌资源的开发利用提供了基础.

葡萄白腐病拮抗链霉菌G4的筛选、鉴定及发酵条件的优化

从长春市葡萄园采集的9份土样中分离出放线菌菌株70株,采用平板对峙法初筛到了对葡萄白腐病菌(Coplodiella diplodiella)有较好拮抗作用的放线菌菌株7株,采用琼脂扩散法复筛出拮抗作用最好的菌株G4。对G4菌株的发酵液进行了抗菌谱测定,结果表明发酵液对番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)等其他8种植物病原真菌都有拮抗作用,对葡萄白腐病菌的拮抗作用最好,抑菌圈直径达26.5mm。通过对菌株G4的形态特征、培养特征、生理生化反应和16S rDNA鉴定该菌株为淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)。通过发酵条件优化,确定了菌株G4的最佳发酵条件:玉米粉60 g/L,葡萄糖30 g/L,大豆粉60 g/L,硝酸钾5 g/L,磷酸二氢钾1 g/L,碳酸钙3 g/L,氯化钠1 g/L,pH为自然,种龄22 h,装瓶量40mL/250mL,接种量4%,发酵温度28℃,转速200 r/min,发酵时间48 h。

淡紫灰链霉菌S3-5田间防效初探及生防制剂助剂的筛选

尾孢菌(Cercospora zeae-maydis)是引起玉米灰斑病的病原真菌,淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)S3-5为课题组前期研究筛选出的尾孢菌拮抗菌株。为探究S3-5在田间对玉米灰斑病的防治效果,并研制有效防控玉米灰斑病的生防制剂,该研究进行田间试验,并对S3-5稳定剂及紫外保护剂进行筛选。结果表明,初步应用S3-5孢子悬液于田间栽培品种正红311上,发现其对玉米灰斑病具有一定的防治效果,喷施两次的效果更显著(P<0.05);最佳稳定剂为2.5%甲基纤维素,最佳紫外保护剂为0.3%异维C钠。可为S3-5制剂的后续研究奠定基础。

玉米灰斑病拮抗链霉菌S3-5的筛选及鉴定

为筛选对灰斑病有高效拮抗作用的微生物,采集四川双流、平武以及云南文山州三地玉米种植田土壤,利用平板对峙实验筛选到对灰斑病病原菌玉蜀黍尾孢菌（Cercospora zeae-maydis Tehon＆Daniels）菌丝生长有抑制作用的6株细菌和2株放线菌.放线菌S3-5的抑菌效果最好,其抑菌能力是可稳定遗传的性状;结合菌株形态学、生理生化特征以及16S rDNA序列同源性分析将S3-5鉴定为淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendulae）.S3-5对玉蜀黍平脐蠕孢、立枯丝核菌、茄链格孢、核盘菌、胶孢炭疽菌、链格孢菌等常见植物病原真菌均有较好抑制作用,其生长的NaCl浓度耐受度为5%,最适生长温度为25~30℃,显示S3-5具有应用于田间抑制灰斑病发生的潜能.

淡紫灰链霉菌H2产α-葡萄糖苷酶抑制剂发酵条件优化

采用响应面的方法对淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)H2产α-葡萄糖苷酶抑制剂的发酵条件进行优化,经过单因素试验和Plackett-Burman试验设计筛选出对产α-葡萄糖苷酶抑制剂影响较为显著的3个因素:初始pH、接种量、发酵时间,利用最陡爬坡试验确定Box-Behnken中心组合试验设计的中心点,然后进行中心组合试验对发酵条件进行优化,得出最佳发酵条件为初始pH值为6.5、发酵时间4 d、接种量9%,经过3次试验验证,该发酵液抑制率稳定在68.79%,与预测值相接近。

链霉菌原生质体种间融合提高细胞分裂素效价的研究

本文报道粉红孢类群的泾阳链霉菌与淡紫灰链霉菌不液化亚种的原生质体种间融合重组的结果。利用单亲灭活和双亲株的遗传标记筛选细胞分裂素的融合子,融合率为10^(-4)—10^(-2)。在所得的融合菌株中,F1211菌株的CTK效价为292μg/L,F1613的CTK效价为857μg/L,比低产原始亲株提高2—7倍,比高产亲株提高0.3—3.0倍。在电子显微镜下观察到融合过程。